申克孢子丝菌聚合酶链反应诊断及其相关技术的研究进展

田超群综述，周 汛审校（重庆医科大学附属第一医院皮肤科 400016）

孢子丝菌病又称玫瑰花园丁病，是由申克孢子丝菌引起的皮下组织真菌病，孢子丝菌由Schenck于1898年在美国分离[1]。申克孢子丝菌分布于全球的土壤中，而孢子丝菌病则局限于墨西哥、中南美洲和其他地区，最常见的感染方式是皮肤接种，最典型皮损是淋巴皮肤型或者孢子丝菌病样型，即原发部位感染后沿淋巴管播散的类型。申克孢子丝菌为一种双相型真菌，在室温25℃下为菌丝相，37℃下为酵母相，酵母相可在感染者体内增殖，形成小的芽生孢子而致病[1]。临床上常根据患者病史、皮损状况、组织真菌分离培养、组织病理观察、血清学、免疫组化检测等方法诊断孢子丝菌病，但传统诊断方法不仅耗费时间且误诊率高。因此研究一项快速灵敏，特异性高的诊断技术十分必要。分子生物学诊断方法尤其是聚合酶链反应（PCR）及其相关技术，不但简单、快捷，且特异性高，近年来越来越受人们的重视。

1 PCR技术

从1994年Chua等[2]报道使用PCR技术检测申克孢子丝菌以来，基于其操作简单、快捷、准确性高等优点，这项技术越来越多地被人们用于孢子丝菌的研究。PCR技术不仅可用于检测环境中、动物组织、临床皮损中的孢子丝菌，还可用于孢子丝菌与相关类群的分类学研究，发现新的种类，且可用于菌株耐药性研究。朱建国等[3]筛选出申克孢子丝菌特异性引物S2－R2成功鉴定了动物组织、人石蜡切片和临床皮损中的孢子丝菌。应用该引物检测石蜡切片中的孢子丝菌阳性率高达91%，检测临床新鲜活组织中的孢子丝菌，以真菌培养为参照，阳性率可达100%。该方法能够快速、准确地检测出孢子丝菌，敏感性及特异性很高，可以用于临床快速诊断孢子丝菌病。Liu等[4]采用相同的方法检测临床皮损中的孢子丝菌，83.3%（25/30）的皮损中可检测出孢子丝菌，且PCR检测出的孢子丝菌皮损的病例有95.6%真菌培养为阳性。2007年Marimon等[5]采用PCR技术联合不同培养基、不同温度菌株生长率等方法将127例孢子丝菌分为7类，包括S.mexicana、S.brasiliensis、S.globosa和S.schenckii等，并且发现前面3种新分类，这种分类方法一直被世界公认。Oliveira等[6]应用表型实验（phenotypic test）及PCR技术（以钙调蛋白基因为引物）研究40例S.schenckii（包括31例从人体分离的菌株和9例从动物分离的菌株）及其对抗真菌药物的敏感性，结果这40例申克孢子丝菌被分成了4类：S.albicans（n＝1）、S.brasiliensis（n＝1）、S.lueiei（n＝1）和S.schenckii（n＝37），他们的实验得出S.albicans和S.lueiei对伊曲康唑耐药，且对所有唑类药物耐药性均较高。从动物分离的孢子丝菌对伊曲康唑的耐药性高于从人体分离的菌株，但对于特比萘芬和两性霉素B所有菌株的敏感性相差不大，因此，孢子丝菌的准确分类对于治疗药物的选择是相当重要的。PCR还可用于孢子丝菌双向转换技术的研究，Valle－Aviles等[7]用PCR检测出钙/钙调蛋白激酶家族中的新成员：SSCMK1，它可能参与孢子丝菌的双向转换。

2 巢式PCR技术

巢式PCR同PCR一样不仅可用于孢子丝菌诊断，还可用于孢子丝菌分类及其对抗真菌药物的研究，而且有的实验还证明巢式PCR比普通PCR检测孢子丝菌的灵敏性更高[8]。王连明等[9]运用巢式PCR及特异性引物来检测实验小鼠组织中的申克孢子丝菌，11只有明显皮损表现的小鼠中9只可检测出申克孢子丝菌特异性DNA，但并不是所有研究都表明巢式PCR技术优于传统方法。Mendoza等[10]比较真菌镜检、真菌培养、巢式PCR技术和血清学检测小鼠器官中的孢子丝菌，其中真菌培养和抗体检测阳性率较高，而巢式PCR技术和真菌镜检的阳性率稍低。巢式PCR技术还可用于孢子丝菌分类，Xu等[11]运用巢式PCR技术检测38株不同地方的孢子丝菌，他们研究的菌株包括从动物和人体分离的孢子丝菌，并和其他类型的真菌作比较，结果表明巢式PCR技术对于鉴别不同种类的申克孢子丝菌具有很高的敏感性和特异性，为孢子丝菌病的快速诊断提供了一种新方法。Galhardo等[12]分别从申克孢子丝菌的表型和基因型研究菌株对抗真菌药物的最低抑菌浓度，其研究表明菌株的耐药性和基因型是密切相关的，而不同地区的孢子丝菌对抗真菌药物的耐药性也是不同的。

3 限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR－RFLP）技术

PCR－RFLP技术主要应用于孢子丝菌菌种的鉴别，由于其标记需使用内切酶，对实验室及操作人员要求较高，近年来研究较少。Kawasaki等[13]运用线粒体DNA联合PCR－RFLP技术鉴别申克孢子丝菌的两种不同基因型菌株American Type Culture Collection 10268of mtDNA type 1和KMU2025of mtDNA type 4，这两种菌株主要不同点定位于atp9和cox2基因，并且发现这种运用限制性内切酶Asel的方法比其他运用核DNA内部转录区间的PCR－RFLP技术更适合于孢子丝菌种的鉴别。

4 反向PCR技术

反向PCR技术主要用于孢子丝菌的双向转换机制及其基因结构研究，对于了解孢子丝菌病的致病机制有重要意义。Robledo－Ortiz等[14]运用反向PCR技术及简并引物发现了申克孢子丝菌内质网葡萄糖苷酶Ⅱ的编码基因rot2，这个基因编码的蛋白与孢子丝菌的结构、致病性及免疫有关。Hou等[15]的实验中用实时定量的反向PCR技术表明SsDRK1基因在孢子丝菌的酵母相中比菌丝相中表达更高，表明SsDRK1基因可能与孢子丝菌的双向转换机制有关。Nishizawa等[16]发现在申克孢子丝菌的双相转换中Pho85细胞周期素依赖激酶的表达被抑制。通过定量反向PCR检测到在酵母相向菌丝相转换中PhoSs基因的表达下降了30倍，表明PhoSs可能参与申克孢子丝菌双相转换的调控。

5 其他PCR相关技术

其他PCR相关技术，例如交错式热不对称PCR（TAILPCR）、随机扩增多态性DNA（PAPD）等常用于孢子丝菌的流行病学及转基因等。Zhang等[17]将玉米转基因系统用于申克孢子丝菌的插入诱变研究中，并运用TAIL－PCR克隆T－DNA（Transferred DNA转化DNA），为未来医学上重要真菌的正向和反向遗传学研究提供了重要的突变体。Reis等[18]运用PAPD技术及DNA指纹分析技术分析了里约热内卢19例从人体分离的孢子丝菌、25例从猫分离的孢子丝菌和2例其他来源的孢子丝菌，实验表明里约热内卢的动物和人孢子丝菌病有共同的传染源，同时猫在孢子丝菌病的播散中起重要作用。

PCR及其相关技术具有快速、简单、敏感、特异性高等优点，不仅能用于快速诊断孢子丝菌病，还能用于孢子丝菌的分类、药物选择、孢子丝菌病的流行病学研究等方面，具有较大发展空间，是今后孢子丝菌病诊断及孢子丝菌研究的发展方向。对于孢子丝菌病的诊断，尤其对于临床表现不典型及系统性播散型孢子丝菌病的诊断具有更重大的意义，可以明显降低孢子丝菌病的误诊率。而且这些技术能帮助研究孢子丝菌的双向转化机制，对其致病性有更好的了解，能从病因上研究孢子丝菌病。但这些技术由于对操作人员技术及实验室条件要求高，目前仅用于实验室诊断孢子丝菌病，暂未能在临床上大量推广。随着分子生物学技术的不断发展，相信在不久的将来会成为孢子丝菌病临床快速、准确诊断的手段。目前发现与孢子丝菌双向转化相关的基因不多，对其双向转化机制尚不能完全明确，这需要科学工作者作出更大的努力。相信随着新技术的不断开发和研究的进展，最终会明确孢子丝菌双向转化的机制。

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