核磷酸酶基因与肿瘤发生和发展的研究＊

舒 婷综述，姚 军审校（台州学院椒江校区医学院医学检验系，浙江台州 318000）

磷酸酶基因（PTEN）基因即与张力蛋白同源在10号染色体有缺失的PTEN具有调节细胞周期，抑制肿瘤细胞生长、侵袭、转移以及诱导肿瘤细胞凋亡等功能。由于该基因在人类多种肿瘤细胞中存在突变或缺失，因此它被认为是继p53基因之后发现的又一重要的抑癌基因[1]。在一些癌变组织中都有PTEN不同程度的突变或丢失，如神经胶质瘤、进展期的前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肾肿瘤、小细胞肺癌和皮肤黑色素瘤等[1]。PTEN的分布具有组织特异性，在皮肤、结肠、乳腺、前列腺等组织细胞中，PTEN主要分布于细胞质中；在神经细胞、成纤维细胞、肾上腺髓质、甲状腺等组织细胞中，PTEN分布于细胞核中；在极化的MDCK犬肾细胞，PTEN位于细胞间的紧密连接处[2－3]。细胞质PTEN具有负调控磷脂酰肌醇－3－羟基激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信号转导通路的作用[4]；但新近的研究表明，PTEN的核移位可能促成其肿瘤抑制活性[3]。

1 PTEN的结构与功能

PTEN定位于10q23.3染色体，全长200kb，包含9个外显子和8个内含子。其cDNA的5′端是由804个核苷酸组成的非编码区，含多个CGG三核酸重复序列，为甲基化提供了基础[1]。PTEN的高甲基化使基因处于静止状态，导致PTEN低水平转录及PTEN蛋白的减少甚至缺失[1]。非编码区后是开放阅读框，由1 209个核苷酸组成，PTEN mRNA长5.5kb，编码403个氨基酸的蛋白产物。PTEN的第5外显子十分重要，参与编码PTEN蛋白磷酸酶核心基序[1]。

PTEN蛋白由N端的磷酸酶结构域、C2结构域及C端结构域组成[5]。PTEN蛋白的C端尾部结构域是一个由约50个氨基酸组成的，主要包括2个氨基酸单字母编码（PEST）结构域序列和一个 PDZ（PSD－95/Dig/ZO1）同源结构域结合序列[5]。PEST结构域序列为一富含脯氨酸（P）、谷氨酰胺（E）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）等10个氨基酸组成的结构序列[5]。PEST结构域序列有助于蛋白折叠，若其缺失将导致PTEN的降解速度加快[5]。因此，PEST序列的存在对PTEN蛋白的稳定性和细胞膜定位有一定作用，如果将其敲除，则可通过影响蛋白折叠导致PTEN表达下降[6]。PDZ同源结构域结合序列位于C末端的第400～403位氨基酸，是蛋白质间相互作用的结构域[5]。其主要通过参与蛋白质间的相互作用来增强PTEN磷酸酶活性和信号通路的转导效率，即PTEN蛋白可通过PDZ结构域结合序列与其他含有PDZ结构域结合序列的蛋白相互作用而影响PTEN功能，也有维护PTEN蛋白稳定性的作用[5]。

PTEN蛋白的N端有1段与细胞张力蛋白、辅助蛋白同源的序列，含有177个氨基酸，为主要的结构功能区[7]。细胞张力蛋白是一种细胞骨架蛋白，而辅助蛋白与神经突触小泡的运输有关[7]。PEST同源结构域有助于蛋白折叠，如果其缺失将导致PTEN迅速降解；PDZ结合基序的缺失不影响PTEN降解，不过它可与PDZ蛋白相互作用，可能有利于PTEN的定位以及与别的蛋白质的相互作用[7]。PTEN通过PDZ结合基序与上皮细胞膜紧密连接上膜相关反向鸟苷酸激酶－2的PDZ结构域结合，来加强PTEN抑制 Akt活性[8]。由此可见PTEN的C端特殊区域在调节PTEN的稳定性和酶活性方面非常重要，其突变可逆转抑癌基因的表型，影响突变体的稳定性和磷酸酶活性[8]。

2 PTEN的核转位机制

PTEN如何进入核内是目前的研究热点之一，有研究表明泛素化能调控PTEN的核输入。Trotman等确认Cowden综合征家族患者PTEN的1个赖氨酸突变为谷氨酸（K289E），他们通过分析有这种生殖细胞突变患者的肠息肉，展示了K289E突变蛋白已从发育异常的上皮细胞核中除去，进一步展示了超量表达的绿色荧光蛋白（GFP）－PTEN，K289E融合蛋白主要位于细胞质，而野生型GFP－PTEN融合蛋白在细胞核和细胞质中都存在[9]。PTEN的这种分布异常与其磷酸酶活性无关，而是由于细胞核输入的极大降低（无细胞核输出增加）导致的[9]。此外赖氨酸13被确认是转染细胞内的第2个泛素化位点[9]。这个最初在散发脑肿瘤患者中发现的赖氨酸突变体K13E中断了PTEN的核转位，并减少了PTEN核输入[9]。可见K289和K13这2个赖氨酸残基作为泛素化位点，是PTEN穿梭和核输入所必需的[9]。

泛素化是由一系列酶连续催化的反应，研究表明核内PTEN随着泛素化的增加而剧烈增加，尤其是单泛素化[9－11]。PTEN受多泛素化影响而在胞浆内储留，并最终被蛋白酶体降解[9－11]。单泛素化的PTEN在核内特异浓缩，这证实单泛素化的PTEN是最有效的穿梭模式，但具体机制尚不明确[9－11]。可能是由于单泛素化通过某些机制增强了PTEN核输入的信号，或者通过其他独立的进程所致。而且核定位的PTEN与染色体的稳定性有关，神经前体细胞表达的进行性下调基因（NEDD4－1）可通过泛素化调控 PTEN 入核和抑癌作用[9]。PTEN泛素化是通过NEDD4－1介导的，其生理过程非常复杂[10]。NEDD4－1是PTEN主要的E3泛素化连接酶，可以连同PTEN其他位点一起泛素化K289[11]。抑制NEDD4－1能使PTEN在胞浆内重新分配，而NEDD4－1过度表达将增加PTEN的核转位[11]。

单泛素化的PTEN富含于核碎片中，不是所有的核PTEN都能被单泛素化，这提示PTEN在细胞核中被泛素移除或者部分核PTEN没有通过泛素化进入核内[11]。显然，针对核中PTEN去泛素化酶的鉴定，可解释另一调节PTEN稳定和定位的规律。与此相反，单泛素化能介导PTEN进入核内并增加其稳定性[9]，然而通过NEDD4－1介导的PTEN多泛素化会加强PTEN的降解[10]。虽然核内的单泛素化PTEN浓缩增多，但PTEN并不都是通过单泛素化入核的，这表明PTEN在核内有去泛素化，或者一部分PTEN没有经过泛素化入核，但这一机制尚不清楚[9－11]。

3 核PTEN的功能

核PTEN对细胞的许多生物学功能均有影响：（1）与p53形成的核内复合体能抑制p53降解并增加p53的转录活性[12－13]；（2）可不依赖于抑制 Akt的活性来阻止细胞的增殖[14]；（3）可下调细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）水平并能阻止丝裂原活化蛋白激酶磷酸化[15]；（4）调控PIP结合受体类固醇生成因子－1和肝脏受体类似物的活性[16－17]；（5）外源性PTEN入核可增加细胞凋亡[3]；（6）参与维持染色体的稳定性[3]。

4 核PTEN与肿瘤

核PTEN是怎样抑制肿瘤发生和发展的呢？最近研究发现，PTEN可以通过单泛素化进入细胞核，并通过诱导细胞周期停滞和维持染色体完整性而起到肿瘤抑制的作用[18]。Shen等[18]发现阻止PTEN表达可造成染色体破碎片段增加，从而出现着丝粒和染色体易位。核PTEN有维持染色体稳定和完整的功能，可能是通过与着丝粒特异结合蛋白－C的相互作用以维持染色体的稳定性来促进DNA修复家族Rad51转录调节的修复及减少DNA双链的断裂。因此，核PTEN可能和p53蛋白一样，可以起到维持基因组稳定的作用。

4.1 核PTEN与胃癌 胃癌是一种常见的恶性肿瘤，目前认为胃癌的发生、发展是一个有序的、多阶段、多步骤的过程，并且是多种因素的综合结果，但主要是因为抑癌基因的失活和癌基因的活化。核PTEN表达下调的分子基础是由基因突变、过度甲基化等构成。Hino等[19]发现，胃癌组织中核PTEN有较高的阴性表达率，并伴有mRNA及总蛋白水平降低。Wang等[20]也发现，60例进展期胃癌中有17例（28.3%）存在核PTEN基因突变，其中包括8例错义突变、5例沉默突变、2例无义突变、1例碱基缺失和1例内含子拼接供体位点突变。因此，核PTEN基因突变在进展期胃癌的发生中可能起重要作用。

Bai等[21]研究表明，核PTEN高表达的肿瘤患者预后显著好于核PTEN低表达的患者，核PTEN和淋巴结转移呈负相关，分化程度低的胃癌患者低表达核PTEN。核PTEN的表达还与Lauren′s分型有关，说明了核PTEN可能抑制胃癌的发生和发展，与既往在细胞质表达的PTEN研究结果相一致[22]。因此，核PTEN可能作为胃癌分子分型的潜在生物标志物和治疗靶点。

4.2 核PTEN与结肠癌 核PTEN在正常结肠黏膜组织的表达也显著多于结肠癌组织，而且核PTEN的表达与结肠癌肿瘤的体积及血液转移的发生呈负相关[23]。有其他研究发现，核PTEN的表达在正常组织－腺瘤－腺癌－转移这一序列中依次下降，提示核PTEN表达对于结肠癌的发生和发展至关重要，并发现核PTEN表达的缺失是Ⅱ期结肠癌患者预后不良的重要指标之一[24]。

4.3 核PTEN与其他肿瘤 Gil等[25]研究发现PTEN磷酸化影响其核、质定位。PTEN的第380位上的丝氨酸被丙氨酸取代和第383位上的苏氨酸被丙氨酸取代突变体主要定位于细胞核中，由于该突变体不能发生磷酸化修饰，提示非磷酸化PTEN更倾向定位于细胞核。然而Chung等[26]用同样的PTEN突变体在人乳腺癌MCF－7细胞中研究却未发现突变对PTEN核、质定位有影响。体外突变体实验得到的这些矛盾结果促使学者对内源性PTEN磷酸化与其核、质定位的关系进行深入研究。有研究表明，细胞缺氧24h时，细胞核中PTEN蛋白含量明显增高，而Westem blot结果显示磷酸化的PTEN降低，总蛋白未见降低，即非磷酸化的PTEN蛋白增多，提示缺氧可降低PTEN磷酸化水平，促进PTEN的核定位[27]，这与Gil等[25]发现的非磷酸化PTEN倾向定位于细胞核的现象一致。

在舌鳞癌组织中，PTEN蛋白的表达主要定位于细胞核，PTEN的阳性率缺失表达可能参与舌鳞癌组织的分化过程。核PTEN通过拮抗低氧诱导因子－1α、基质金属蛋白酶－9，而在舌鳞癌的发生、发展和侵袭过程中发挥抑制作用[28]。在人神经胶质细胞瘤U251MG细胞中，不需抑制Akt信号转导通路，核内的PTEN就能够抑制癌细胞的生长，促使细胞增殖停滞在G1期[14]。又有研究发现，肝癌组织中53.1%的核PTEN呈阳性，而核PTEN蛋白的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度均无相关性[29]。NEDD4－1并不是在所有情况中都具有致癌性，因为其并不能完全消除PTEN水平[11]。在大量浸润性膀胱癌标本中，发现浸润性膀胱癌与NEDD4－1的升高和PTEN蛋白减少存在一定联系，但是在NEDD4－1和PTEN表达之间不存在持续性负相关，这可从NEDD4－1为调控PTEN稳态水平的主要调节因子这一简易模型中预测到[11]。

5 结语及展望

尽管核PTEN及细胞质PTEN均有肿瘤抑制功能，在肿瘤的发生和发展中起重要作用，但是核PTEN的作用及其机制与细胞质PTEN是不尽相同的。越来越多的证据表明，是否有多个PTEN的核输入机制取决于细胞类型和细胞内外微环境。核PTEN在调节细胞动态平衡和稳定中起强有力的作用，它有助于维持染色体的稳定，促进DNA修复和诱导细胞周期阻滞。针对核PTEN的研究将有助于深入探索PTEN与肿瘤发生和发展的关系，还有助于在分子水平上揭示肿瘤的发生、发展、浸润和转移机制，为筛选肿瘤标志物、早期诊断和寻找有效治疗方法打下基础。

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