Smyd1基因选择性剪接的组蛋白修饰机制调控应力刺激下骨骼肌肥大作用研究进展

王平 漆正堂 丁树哲

1 杭州师范大学体育与健康学院（杭州311121）2 华东师范大学体育与健康学院

国内外学者普遍认为，长期反复抗阻运动能够导致骨骼肌肥大。成体骨骼肌肥大的特性是肌纤维直径增加、体积增加，使骨骼肌收缩能力增强，导致骨骼肌质量增加，而不是肌纤维数量的增多［1］。骨骼肌质量在维持运动、呼吸和新陈代谢等功能独立性方面具有举足轻重的作用，因此，研究抗阻运动与骨骼肌肥大之间潜在的分子机制是非常重要的。已有研究显示，整个机体功能的最大赤字出现在低到中等范围的肌肉力量输出。骨骼肌质量的丢失具有阈值，如果超过此阈值，将会导致肌肉萎缩，肌肉功能独立性衰退甚至丧失，故骨骼肌质量发生微小变化可能对于骨骼肌功能的改变起着决定性作用［2］。因此，研究调控骨骼肌肥大机制对于长期伤残患者预防骨骼肌发生萎缩至关重要，同时为治疗与骨骼肌萎缩相关的其他疾病提供有效途径。

早期阶段关于骨骼肌肥大方面研究发现，骨骼肌总蛋白含量明显增加，蛋白质合成率也明显增加，但是总RNA含量并没有改变。随后在Carson的研究中发现，总RNA含量发生明显增加，只不过发生的时间明显滞后，提示骨骼肌肥大机制中调控蛋白质合成是至关重要的［3］。由于骨骼肌质量变化是持续的，故我们可以这样理解，基因翻译促进了RNA含量的增加。

但最近Kawai等［4］的研究发现，抗阻运动性骨骼肌肥大过程中肌卫星细胞起着关键作用，提示其机制之一与肌卫星细胞的激活密切相关。

肌卫星细胞是在出生后的骨骼肌中发现的，在成体骨骼肌中，肌卫星细胞基本处于安静状态，属于肌源性干细胞［5］。最初，卫星细胞是通过电子显微镜观察鉴别出来的，其呈独特的卫星形状，以楔形位于相邻成熟肌纤维基底层和肌浆之间［6］。已有研究显示，在成人肌肉中，卫星细胞绝大多数时间处于新陈代谢休眠期或静止状态，但是当肌肉受到抗阻运动刺激后，静息的卫星细胞被激活，从延长的G1态（经常被称为G0）进入细胞周期，进行DNA复制、增殖、分化，与周围的肌纤维发生融合或形成新的肌纤维［7］。通过这个过程，许多肌细胞核聚集在肌纤维中，为蛋白质合成的增加提供原料，为骨骼肌肥大核再生提供生物学基础。因此，卫星细胞的激活（即卫星细胞从休止状态进入G1期和随后DNA复制）是肌肉生成的第一步，也是关键的一步，同时为肌肉增长和再生提供了非常重要的依据［8］。已有研究表明，抗阻运动激活卫星细胞，随后卫星细胞发生如细胞膨胀、细胞数量增加、细胞核明显增加等形态学改变，最终导致骨骼肌肥大［9］。那么抗阻运动是如何激活卫星细胞的呢？已有研究显示，卫星细胞激活过程中受到诸多肌细胞生成基因的调控，其中Smyd1基因起着核心作用［10］。故通过研究卫星细胞激活如何被调控，将有助于设计出更好的促进骨骼肌肥大和发育及康复的方案，对于提高运动骨骼肌机能和促进肌萎缩的辅助治疗等方面具有重要的作用。

1 Smyd1的生物学特性

1.1 Smyd1的生物学作用

骨骼肌肥大过程是一个严格程序化过程，目前研究表明，卫星细胞的激活提供新的肌细胞核，是肌纤维肥大的第一步，也是关键的一步。其具体过程是卫星细胞激活、增殖，变为成肌细胞后分化成为肌细胞，然后融合成多核肌管，最后形成与肌肉收缩密切相关的成熟的多核肌纤维［11］。在上述过程中，卫星细胞除了提供新的肌细胞核外，还强化肌肉特异性基因的表达。

Smyd1（也称肌肉特异性BOP基因）是近年来发现只在骨骼肌和心肌细胞特异表达的蛋白，它包括MYND和SET结构域。其中SET结构域高度保守，约含130个氨基酸，具有组蛋白赖氨酸甲基转移酶的活性。同其它甲基转移酶相比较，含有保守的SET结构域的组蛋白甲基转移酶具有一个独特的折叠结构，一系列连续的β折叠插入3个非连续的片层中，环绕围成一个类似于绳结的三级结构［12］。如此与众不同的结构是SET结构域C末端片段插入蛋白末端序列向前延伸围成的环状结构形成的，C末端片状和环状结构包含了SET结构域中最保守的两个基序，分别是ELXF/YDY和NHS/CXXPN（X代表任意氨基酸）［12］。哺乳动物组蛋白甲基转移酶的SET结构域主要由核心 SET结构域，pre-SET和 post-SET结构域组成，核心SET结构域的侧面与 pre-SET和post-SET结构域相连接，pre-SET结构的主要作用是维持整个蛋白结构的稳定性，post-SET结构则提供一个芳香基团形成疏水通道，参与构成部分酶活化位点［13］。另外，SET结构域还含有一个称为iSET的插入结构，特异性识别甲基转移酶的底物和辅助因子［14］，其主要功能是调节基因活性，但具体机制尚不清楚。另外，MYND结构域也高度保守，带有锌指结构，含有 7个高度保守的半胱氨酸残基，唯一的组氨酸残基穿插于其中，此结构与DNA粘合在一起，与组蛋白脱乙酰酶发生作用。这两个功能结构域在肌细胞激活、分化、成熟的调控中起着关键性作用，同时与组蛋白甲基化修饰密切相关［15］。已有研究在敲除小鼠Smyd1基因后发现，小鼠心肌的成熟和右心室的形成受到影响，突变小鼠死于胚胎期10.5天［16］。有研究利用Morpholino反义寡核苷酸技术特异性下调斑马鱼Smyd1蛋白，结果发现胚胎肌纤维发育不成熟，肌肉收缩障碍［17］。体外分子生物学实验证明Smyd1基因具有甲基转移酶活性，催化的H3-K4甲基化，激活靶基因的表达［18］。

1.2 Smyd1基因选择性剪接

科学家于2001年宣布完成了人类基因组框架图后，即注意到一个有趣的事实，人类基因为什么不是原来预计的8万到10万个，而是3万个左右？而于2004年完成的人类基因组常染色质区测序进一步表明，人类的基因只有2—2.5万个左右［19］。人类基因组计划首席科学家Collins认为，人类基因数比预计的要少得多，说明高等生物在使用基因上的简约性。与过去一个基因编码一种蛋白的假设相比，现在是每个基因负责制造三种蛋白质，高等生物不单纯靠增加新基因来获取新功能，还可以通过重新编码扩充已有的可靠资源达到创新的目的。选择性剪接的存在正是人类节约使用基因的最好例证［20］。已知可增加蛋白质种类和数量的方式有DNA重组、RNA编辑和选择性剪接等，而Pre-mRNA的选择性剪接是产生如此众多蛋白质的主要机制［20］。实际上，mRNA的选择性剪接发生的频率很高。根据深层次的测序研究，目前估计，人类基因有90%以上都经历了选择性剪接［21］。其中70%～88%的选择性剪接产生了不同的蛋白质产物，大多数都涉及功能的改变，如通过蛋白质的氨基端或羧基端，或者增删了某个功能域而使其功能发生改变。

选择性剪接是高等真核细胞在转录后水平调控基因表达以及产生蛋白质组多样性的重要机制。传统意义上认为，选择性剪接主要受剪接增强子和沉默子的调控［22］，它们属于比较保守的RNA序列，大约10 nt的长度，可位于外显子也可位于内含子上，与剪接调节蛋白结合从而调控选择性剪接［23］。而最近研究表明，组蛋白修饰与选择性剪接有密切关系。例如，加入组蛋白脱乙酰基酶抑制剂TSA后，可引起纤维结合蛋白的外显子33被切除，还有神经细胞粘附分子的外显子18也可被切除［24］。 Andrea 等［25］的研究也发现，使用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂 TSA或 DNA甲基化酶抑制剂 5-5azadC-dC都可以诱导Shc基因的选择性剪接产物 p66在平时不表达的组织中出现。这些研究说明组蛋白修饰在不同基因的选择性剪接中起着重要作用。

Tan等［26］研究通过使用不同的引物（RT-PCR分析）证实Smyd1基因存在选择性剪接，其选择性剪接产物是Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）。 Smyd1a为编码486个氨基酸残基的蛋白质，而Smyd1b（Smyd1-△Exon5）为编码473个氨基酸残基的蛋白质，Smyd1a包含一个额外的13个氨基酸插入序列，插入位置在215-227，这13个氨基酸的插入是由Smyd1a的第5外显子编码的，它们的区别是Smyd1b缺乏第5外显子（Smyd1-△Exon5），可能影响其生物学作用。Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）是Smyd1家族高度保守的成员，它们都包括SET结构域和MYND结构域。Smyd1基因发生选择性剪接产物分别为Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）。 Tan等通过RT-PCR分析证实，Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）在时间和空间上的表达方式完全不同，Smyd1a转录发生于骨骼肌发育过程中第6个小时，而Smyd1b（Smyd1-△Exon5）的转录晚于前者5小时才出现，提示通过选择性剪接产生的Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）表达具有时序性。他们为了进一步证实Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）在骨骼肌发育中的作用，分别进行了将Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）基因同时敲除，和只将Smyd1a敲除的实验，结果发现，如果将二者均敲除，发育肌肉具有形态学特征，但不能游泳，进行刺激时也没有任何反应；如果只敲除Smyd1a基因，对肌肉发育没有任何影响，动物能进行游泳，也能进行正常收缩活动。免疫组化研究结果显示，肌原纤维排列正常，提示Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）也许有更多的生物学功能，Smyd1b（Smyd1-△Exon5）对于肌肉发育起着重要作用。Smyd1基因的选择性剪接体Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）在人类、啮齿类动物和斑马鱼等动物的心肌和骨骼肌组织中特异性表达且含量丰富，这与已经证实了的Smyd1在心肌组织和骨骼肌组织中发挥重要作用是相对应的［27］。此外，在啮齿类和斑马鱼的肌肉组织中Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）的表达与人的高度一致，这说明了Smyd1基因在进化上的保守［28］。通过实验发现，该基因受到血清反应因子（SRF）和成肌素（myogenin）的直接调控，在C2C12细胞培养中，SRF和myogenin的过度表达明显增加了Smyd1基因的表达，如果将SRF基因敲除后发现，Smyd1mRNA表达明显减少［29］。但是关于Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）表达调控和生物学作用的区别是什么，还需进一步研究。Smyd1基因在抗阻运动性骨骼肌肥大过程中是否发生了剪接，剪接性产物是否是Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5），且其分别起着怎样的作用，仍需探索。

2 组蛋白修饰机制对S my d1基因选择性剪接的调控作用

2.1 组蛋白修饰

DNA和组蛋白H2A、H2B、H（3、H4、H1）以及一些其他蛋白质组合在一起，反复折叠缠绕，形成浓集的染色体。而组蛋白修饰可影响组蛋白与DNA的亲和性而改变染色质的状态，影响转录因子和DNA序列的结合，对基因表达进行调控［30］。组蛋白修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、SUMO化、ADP-核糖基化［31］。他们通常发生在组蛋白氨基末端，影响基因转录、翻译和细胞调控。组蛋白氨基末端修饰的方式和数量不同可产生不同的表观遗传学信息。在这些组蛋白修饰中，研究较早和较详细的是组蛋白乙酰化，近年来对组蛋白甲基化修饰的研究也进展迅速。组蛋白甲基化修饰比乙酰化修饰复杂得多。一般来说，组蛋白乙酰化修饰是暂时的，能选择性地使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，为某些基因的转录提供前提，增强其表达水平；而组蛋白甲基化修饰比较稳固，特别是三甲基化修饰，他被认为影响长期表观遗传学记忆。在所有组蛋白甲基化修饰中，某些可抑制基因表达，而某些可增强基因表达，乙酰化修饰和甲基化修饰往往是相互抑制的［31］。组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或赖氨酸残基上的甲基化，由组蛋白甲基化转移酶催化［32］。

2.2 Smyd1作用位点及其转录调控

甲基化发生在组蛋白的精氨酸和赖氨酸残基上，目前发现24个组蛋白甲基化位点，其中7个位于精氨酸，17个位于赖氨酸。目前，数十种组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferase，HLMT）已被证实。其中Smyd1及其它的选择性剪接体均为组蛋白赖氨酸甲基转移酶。其作用位点可能是组蛋白H3-K4和H3-K36位赖氨酸发生甲基化，从而激活基因的转录，其中H3-K4的甲基化必须是在H2B的123位赖氨酸泛素化状态下进行，H2B-K123在泛素化状态时可以募集H3-K4甲基转移酶Set1，Set1进而募集PAF1（RNA polymeraseⅡassociated factor 1，RNA聚合酶Ⅱ相关因子1）延长复合物，当RNA聚合酶ⅡC端呈现磷酸化状态时，就可与延长复合物作用开启基因转录［32］。研究还发现，Ubp8作为SAGA复合体中的一个成员，发挥去泛素化作用，使得H3K4甲基化后呈现去泛素化状态，这样可以募集H3-K36甲基转移酶Set2，当H3-K36甲基化与RNA聚合酶Ⅱ的C端结构域中的第2位丝氨酸磷酸化同时发生时即可激活转录。

3 抗阻运动适应中Smyd1基因选择性剪接的组蛋白修饰调控

从Smyd1对组蛋白修饰的调控来看，Smyd1及其2种选择性剪接异构体均为组蛋白甲基转移酶，它们均与组蛋白上的H3和H4位点结合，调控基因转录激活， 而它们与组蛋白H3-K4、H3-K36、H3-K79、H3-K7、H3-K27、H3-K20等位点结合时会发生基因沉默，从而抑制基因表达，反过来，组蛋白修饰对于基因选择性剪接具有反馈作用。它的反馈证据是通过研究人成纤维细胞生长因子受体2（FGFR）基因得到的［33］。

骨骼肌在抗阻运动作用下发生肥大，由于肌纤维响应应力刺激，肌细胞赖以生存的基质发生改变，应变会引起选择性剪接。迄今为止，已经报道的由应变引起的选择性剪接的基因有胰岛素样生长因子1基因和VEGF基因［34］。 但关于Smyd1基因在应力作用下发生剪接的报道很少。已有的研究发现，在拉伸的应力作用下，Smyd1基因发生了选择性剪接，产生2种重要的剪接体，分别是Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5），这2种剪接体涉及到信号转导通路的调控［35］。因此推测，在正常转录条件下，组蛋白甲基化修饰即组蛋白H3K9乙酰化程度，H3K36甲基化水平，H3K9、H3K27甲基化水平等的变化，决定着 RNA聚合酶Ⅱ延伸速率变化，可对不同的剪接位点进行剪接，由此分别产生以Smyd1a或Smyd1b（Smyd1-△Exon5）为主的产物。简言之，组蛋白修饰机制可能在Smyd1基因选择性剪接中发挥重要作用。

同样，运动机械刺激可能通过组蛋白修饰机制影响Smyd1基因的选择性剪接使Smyd1a或Smyd1b（Smyd1-△Exon5）的量产生变化。 而Smyd1a或Smyd1b（Smyd1-△Exon5）一方面是选择性剪接的产物，同时还兼有组蛋白甲基转移酶的作用，从而反过来影响Smyd1基因的组蛋白甲基化修饰，由此改变染色体结构及选择性剪接格局，从而使RNA聚合酶Ⅱ延伸速率发生改变，对Smyd1基因选择性剪接产生影响。由此可知，当肌肉受到力学刺激时，Smyd1基因发生选择性剪接，首先快速剪接表达Smyd1a，然后剪接转换表达Smyd1b（Smyd1-△Exon5），通过转换表达，能够使Smyd1a和Smyd1b（Smyd1-△Exon5）保持相当长时间的生物学作用，它们均可激活卫星细胞并促进其增殖［26］。卫星细胞一旦被激活，就会增殖、分化，然后与已存在的肌纤维融合，通过这样的过程为肌纤维提供新的细胞核，并使各种基因的表达发生改变，实现肌纤维所需纤维蛋白含量的比率，使肌肉卫星（干）细胞库得到更新，对肌肉质量和功能的持续维持和增加起到重要作用。

4 小结

综上所述，应力运动刺激能通过适度上调Smyd1基因选择性剪接从而对骨骼肌生长和肥大发挥积极作用，并在预防与治疗骨骼肌萎缩及其相关疾病方面具有重要作用。但目前关于抗阻运动性骨骼肌肥大过程中，由于运动刺激，Smyd1如何进行组蛋白修饰，又如何指导基因转录的激活或抑制；反之，组蛋白修饰如何对基因的剪接位点进行选择，实现与骨骼肌肥大密切相关的肌纤维和肌卫星细胞的发生，从而稳定骨骼肌在抗阻运动下发生适应性肥大，增强其收缩功能，维持骨骼肌质量等方面的问题还需要进一步研究。这些问题的解决将有助于更加充分的认知抗阻运动刺激下骨骼肌发生肥大的分子机制，并为今后抗阻运动预防和减轻各种骨骼肌萎缩相关疾病提供理论依据。

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