巨噬细胞在骨骼肌损伤和修复中的作用

王树臣 左群 于新凯

上海体育学院运动科学学院（上海200438）

巨噬细胞是机体天然免疫系统的重要组成成分，在生物体内发挥多种免疫功能，包括吞噬细菌、病毒等微生物，提呈并处理抗原等作用。有研究发现，骨骼肌损伤后早期出现的炎症反应除了传统意义上的吞噬作用外，还能促进卫星细胞的增殖、分化、迁移和融合，对肌肉的修复起着重要作用［1-3］。这其中以巨噬细胞的作用最为明显，它能分泌促进肌肉修复的细胞因子。更为重要的是，研究发现在没有巨噬细胞反应的情况下，肌肉无法再生；对于加强的巨噬细胞反应，卫星细胞的增殖和分化也加强［4-6］。因此，探讨巨噬细胞与骨骼肌损伤和修复的关系对进一步了解骨骼肌损伤和修复的机制具有重要作用。

1 巨噬细胞的分类和功能

巨噬细胞广泛分布于机体各脏器和组织，是一类可塑性强、功能状态呈高异质性的细胞群体。骨髓造血过程中，在某些细胞因子如多集落刺激因子、颗粒巨噬细胞集落刺激因子等的刺激下，骨髓干细胞发育成粒单核前体细胞，后者进一步分化为原单核细胞并进入血液，在此分化为成熟的单核细胞。单核细胞在血液中停留8 h左右，然后穿过毛细血管内皮，迁移到不同的组织，分化成为组织特异性的巨噬细胞。在组织微环境中，巨噬细胞的活化受多种因素影响，如病原微生物的入侵、体内坏死的细胞及碎片、其它细胞分泌的因子等，导致巨噬细胞的吞噬能力、细胞因子分泌能力、抗肿瘤抗病原体能力、对趋化因子作出应答以及抗原的加工递呈能力等发生明显变化［7，8］。

随着人们对巨噬细胞研究的不断深入，巨噬细胞的分类标准也有所不同。2003年，Gordon等［7］总结前人的研究，第一次明确将既往的抗病原微生物的高炎症状态的巨噬细胞称为经典活化的巨噬细胞（classical activated macrophage，简称为caMφ或M1型），其主要功能为识别并清除坏死组织、细胞碎片和病原体；而将IL-4和IL-13处理后表现为低炎症状态的巨噬细胞称为替代性活化的巨噬细胞（alternative activated macrophage，简称为aaMφ或M2型），其主要功能为抑制炎症反应和促进组织修复。Mantovani等［9］进一步对M2分类定义：由IL-4或IL-13诱导的巨噬细胞称为M2a；由免疫复合物、Toll样受体（TLR）和IL-1R配体诱导的巨噬细胞称为M2b；由IL-10、糖皮质激素或开环甾体类激素（如维生素D）诱导的巨噬细胞称为M2c。M2a和M2b型巨噬细胞主要执行免疫调节功能，促进Th2免疫应答的发生；M2c巨噬细胞的主要功能是抑制免疫反应的发生，在组织重塑过程中发挥重要作用［10］。根据巨噬细胞表达抗原的不同，可将巨噬细胞分为ED1、ED2、ED3亚群。不同组织中巨噬细胞亚群分布不同，研究发现正常肌肉组织中主要为ED2巨噬细胞，而ED1巨噬细胞很少［11］。还有学者将巨噬细胞分为促炎性巨噬细胞和抑炎性巨噬细胞。虽然分类标准不一样，但它们的功能基本上一致。

2 巨噬细胞与骨骼肌损伤

Hough［12］在1900 年首次提出肌肉损伤假说，他认为未受训练的肌肉参加长时间的工作可能受到损伤，包括肌纤维损伤和结缔组织损伤。此后100多年的时间里，许多学者围绕骨骼肌损伤机制进行了大量研究，目前认为引起骨骼肌损伤的假说有机械损伤假说、自由基损伤学说、钙离子超载学说和急性炎症反应学说等。随着对骨骼肌损伤机制研究的不断深入，研究人员发现炎症反应对于骨骼肌损伤具有双重作用，骨骼肌损伤后炎症反应的过程逐渐成为研究焦点。

炎症反应可以由不同因素引起，如病原体、化学因子、物理因子、机械力的作用等。在肌营养不良症的研究中发现，肌营养不良的骨骼肌膜易碎，轻微的机械力或应变就能导致肌膜损伤［13］。然而，一些研究者在对mdx小鼠病变急性期进行研究后认为，机械力直接引起的肌纤维损伤仅占20%～50%，是炎症细胞将肌纤维的损伤扩大了2～5倍，尤其是巨噬细胞［14］。去除炎症细胞后，肌纤维损伤减少50%～80%，说明巨噬细胞可以增加mdx小鼠肌膜损伤。同样的研究发现，在mdx小鼠肌纤维坏死急性期发生之前，剔除mdx肌内的巨噬细胞可以减少70%～80%的肌纤维损伤［15］。另外，通过干扰NF-κB信号通路［16］、糖皮质激素治疗［17］、敲除激活炎症反应的金属蛋白酶基因等手段［18］，均能使mdx小鼠肌膜的病变面积产生相应减少。并且，用自由基清除剂和N-乙酰半胱氨酸对mdx小鼠进行干预，也可以减少NF-κB的活化和炎症反应，同时可减少肌膜损伤［19］。由于肌营养不良症的特点是骨骼肌不能完全进行细胞修复，肌膜反复损伤，同时具有长期的炎症反应［20］，因此，在肌营养不良症中巨噬细胞的作用被认为主要是加强炎症反应，促进肌肉损伤。

那么，巨噬细胞在急性肌肉损伤中是否具有同样的作用，目前还缺乏足够的证据。Lapointe等［21］研究发现，运动诱导肌肉损伤后2～3天，ED1巨噬细胞的募集与肌肉的二次损伤有关。在中性粒细胞浸润减少的情况下，ED1巨噬细胞募集的数量有所增加；但是，在后肢悬吊再负载所诱导的肌肉损伤中发现，肌膜的损伤与巨噬细胞的浸润无关［22］。因此，巨噬细胞在急性肌肉损伤中的作用目前还没有一致的观点，需要进一步研究。

3 巨噬细胞与骨骼肌修复和再生

肌肉损伤后，多种不同的免疫细胞被激活，并被募集到肌肉损伤处。这些免疫细胞对于肌肉的修复与再生十分重要，尤其是巨噬细胞。通过心脏毒素诱导肌肉急性损伤后发现，损伤肌肉中有大量的巨噬细胞浸润。如果在注射肌肉毒素前将巨噬细胞剔除，可减少肌肉的再生［23］。在CD11b-DTR小鼠肌肉修复过程中，肌肉内巨噬细胞（用F4/80hi作为单核细胞/巨噬细胞的标记，它的表达随分化的增加而增加）的去除导致再生肌纤维直径的减少，表明巨噬细胞与肌细胞的分化和肌纤维生长有关［24］。Chazaud等［25］的研究发现，肌肉损伤后1～2天内开始迅速募集循环系统中的单核细胞，在炎症区域转化为巨噬细胞，释放细胞因子、趋化因子等，并吞噬坏死的组织碎片。但也有研究发现肌外膜和肌束膜含有大量的驻留型巨噬细胞，肌内膜的含量较少，这些巨噬细胞控制着肌肉损伤过程中免疫细胞的反应［26］。肌肉损伤后，驻留型巨噬细胞释放中性粒细胞趋化蛋白和单核细胞趋化蛋白 1（Monocyte Chemotactic Protein-1，MCP-1，又名Chemokine(C-C motif)ligand 2，CCL2），这两种细胞因子趋化循环系统中的中性粒细胞和单核细胞做定向运动［27］。其中，CCL2对单核细胞的趋化作用是通过结合单核细胞表面的特异性趋化因子(C-C基元)受体2（C-C chemokine receptor type 2，CCR2）实现的。研究发现，CCR2突变体小鼠的肌再生面积明显减少，证明CCR2在肌肉再生过程中具有重要作用［28］。之后，有研究进一步发现骨髓源细胞CCR2的表达可以减少肌纤维坏死的面积和增加新生肌纤维的面积。如果没有CCL2或CCR2，免疫细胞无法被激活或募集到肌损伤处，成肌前体细胞也不能完全分化［29］。

骨骼肌的修复与再生过程中，成肌前体细胞必不可少，它可以分化为肌细胞并融合成肌管，最终形成新的肌纤维。注射成肌前体细胞成为新的治疗骨骼肌损伤、肌营养不良症等的方法。但是，移植后的成肌前体细胞的成活率及迁移能力相当弱。由于巨噬细胞存在于骨骼肌损伤与修复的整个过程中，巨噬细胞能否对成肌前体细胞产生作用值得探讨。

Saclier等［30］对不同类型巨噬细胞与成肌前体细胞的相互作用进行了研究。通过健康成人肌肉再生的在体实验发现，成肌前体细胞的增殖与M1型巨噬细胞有关；体外实验结果发现，M1型巨噬细胞通过分泌IL-6、IL1-β、高浓度TNF-ɑ、VEGF和IL-13向成肌前体细胞迁移，刺激成肌前体细胞的增殖和抑制其过早分化。此外，成肌前体细胞分化和肌再生与M2型巨噬细胞有关；M2型巨噬细胞可以吸引成肌前体细胞向其迁移，并通过分泌TGF-β和低浓度TNF-α刺激成肌前体细胞生成肌细胞以及成熟肌管，促进肌生成。Lesault等［31］将巨噬细胞和成肌细胞一起注射到mdx小鼠的胫骨前肌中，结果提高了成肌细胞的存活率，促进了成肌细胞在组织中的扩张，提高了成肌细胞的迁移能力；体外实验也证实了巨噬细胞可以刺激成肌细胞的粘附和迁移。另外，Bencze等［32］将人体的巨噬细胞（促炎性巨噬细胞或抑炎性巨噬细胞）和成肌细胞一起注射到Rag2（-/-）γC（-/-）免疫缺陷小鼠的再生肌肉中，结果表明，促炎性巨噬细胞可以提高注射到体内的成肌细胞参与肌肉再生的能力、扩大增殖范围、增加迁移、延迟分化。由此说明，不同活化状态的巨噬细胞控制着肌肉修复与再生过程中的不同阶段。

巨噬细胞具有复杂的异质性，在不同的组织部位具有不同的功能［33］。体内和体外实验均表明，巨噬细胞有能力适应局部微环境的改变，最终产生新的表型［34］。同时，活化后的巨噬细胞功能大多都是相反的，例如促炎与抗炎、免疫原性与免疫耐受、组织破坏与组织修复等。M1型巨噬细胞与组织损伤有关，而M2型巨噬细胞与组织修复重建有关。在肌肉发生的研究中也已发现，促炎性巨噬细胞的培养基对肌细胞的分化和融合起抑制作用，而抗炎性巨噬细胞的培养基可以刺激肌细胞的分化和融合［35］。由于不同表型的巨噬细胞具有不同的功能，因此，探讨巨噬细胞表型的转移机制就显得尤为重要，但目前相关研究报道较少。Villalta等［14，36，37］从分子水平对巨噬细胞表型转移的机制进行了深入研究，结果发现在mdx小鼠中，IL-10通过抑制M1型巨噬细胞的活化和调控巨噬细胞的表型来减少肌肉损伤，并且巨噬细胞表型的转移与巨噬细胞在精氨酸代谢方面的竞争有关。研究还发现，IFN-γ通过抑制M2型巨噬细胞的活化和肌细胞的增殖，进一步加剧肌肉损伤。近年来的研究发现，IL-10突变体在肌损伤后1天时，扩大了Th1反应，引起IL-6和CCL2的增加，但抑制了CD163和精氨酸酶的增加，说明IL-10在肌肉巨噬细胞从M1向M2表型转移方面起到了重要的调控作用［38］。

4 小结

根据微环境的不同，巨噬细胞通过活化产生不同的细胞表型，执行不同的功能。骨骼肌损伤和修复过程中，巨噬细胞可以从M1型向M2型转移，其中M1型与肌肉损伤有关，M2型与肌肉修复和重建有关。因此，巨噬细胞表型的转移是影响骨骼肌损伤和修复的关键，但转移机制目前尚未明确。同时，巨噬细胞可以分泌大量的细胞因子和生长因子，通过这些因子影响肌肉修复和再生。因此，探讨巨噬细胞表型的转移机制以及相关因子对骨骼肌损伤和修复的作用，将成为骨骼肌损伤和修复研究中的新内容。同时，这些问题的阐明也将为运动性肌损伤、肌营养不良症、肌萎缩等肌肉疾病的治疗提供有益的借鉴。

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