超声波提取金针菇根中的蛋白质*

张乐，宋洪波，周林燕，李鹏，魏明，彭春红，李亚茹，曹珍珍，李淑荣

1 (福建农林大学食品科学学院，福建 福州，350002)2 (中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室，北京，100193)

金针菇(Flammunlina velutipes)为担子菌目金钱菌属，是一种药食两用真菌。金针菇含有丰富的多糖、蛋白质、多种维生素(VB1、VB2、VC、Vpp)、矿物质和18 种氨基酸，其中精氨酸和赖氨酸等人体必需氨基酸的含量高于其他菇类［1-3］。金针菇中的生物活性物质多糖、火菇素、倍半萜、免疫调节蛋白等具有抗氧化、抗疲劳、提高记忆力、减缓细胞衰老等功效［4-6］。随着人们对其营养价值的认识，金针菇的消费量越来越大。而金针菇菌柄基部(俗称金针菇根)因其杂质、纤维素等成分较多，口感较差，售前或食用前被切下来直接被当作垃圾扔掉。这些下脚料中仍然含有大量的蛋白质、纤维素等营养成分及活性成分，造成极大浪费［7-8］。

为了充分开发利用金针菇废弃菌根，有效提高金针菇下脚料的价值，满足工业产业化生产的要求，本文以金针菇菌柄基部(菌根)为材料，进行超声辅助提取菌根蛋白的研究，并利用响应面分析法进行提取工艺优化，以获得最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金针菇，购于北京市天秀路菜市场;NaCl、NaOH、盐酸等，购于国药化学试剂有限公司，分析纯;牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250，购于美国Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9140A 电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;SL-100 型高速多功能粉碎机，浙江省永康市松青五金厂;KQ2200DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;pB-10 sartorius 普及型pH 计，美国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;HH-4 数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;全自动凯氏定氮仪，丹麦FOSS 公司;TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 金针菇菌根粉末的制备

将金针菇清理去杂后把上部子实体和菌根切分，取菌根放入电热鼓风干燥箱50℃烘至恒重，万能粉碎机粉碎，过100 目筛贮于干燥器备用。

1.3.2 金针菇菌根蛋白的提取

称取已制备好的金针菇菌根粉，按料液比1∶15(g:mL)加入稀盐提取剂(0.14 mol/L NaCl)摇匀，调pH10，移入超声波清洗器，设置不同的提取温度、时间、超声功率提取蛋白。将料液转入离心管8 000 r/min 离心20 min，取上清液，考马斯亮蓝法测蛋白含量。

1.3.3 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

准确称取10 mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 mL，配制成100 μg/mL 的牛血清白蛋白标准溶液，分别取出0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于6支具塞试管，分别加水补足到1 mL，然后各加入5 mL考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂盖上塞子，摇匀，室温静置2 min 后在595nm 波长下比色测定。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线，得回归方程Y=0.006 4X + 0.005 6，相关系数R2=0.999 1。

1.3.4 蛋白提取率计算

蛋白提取率/% =(上清液中蛋白质量/菌根粉中总蛋白质量)×100

其中菌根粉总蛋白测定采用凯氏定氮法(GB/T 15673 -2009);提取液蛋白的测定采用考马斯亮蓝G-250 法［9-10］。

1.3.5 单因素试验

在碱提基础上以料液比1∶15(g∶mL)、0.14 mol/L NaCl 为提取试剂、提取液pH 10 进行单因素实验，考察超声功率、超声温度、超声时间、超声材料4 个因素对菌根蛋白提取效果的影响。单因素试验条件见表1。

表1 超声提取的单因素试验条件Table 1 Single factor experiment of ultrasonic extraction conditions

1.3.6 响应面试验设计

在单因素试验基础上，以超声功率、提取温度、时间为自变量，蛋白提取率为响应(y)，采用Box-Behnken 设计三因素三水平试验，建立超声辅助提取金针菇菌根蛋白的二次多项式数学模型［11］。

1.4 数据分析

采用Origin 8.0 软件进行数据处理和绘图;通过Design-Expert.8.05b 软件进行响应曲面模型建立和分析。

2 结果与分析

2.1 菌根蛋白提取率影响因素的研究

2.1.1 超声功率对蛋白提取率的影响

不同超声功率对金针菇菌根蛋白提取率的影响试验结果见图1。由图1 可以看出随着超声波功率的增加，蛋白提取率先增大后减小，当超声波功率为120 W 时，提取率达最大值。分析是因为当功率较小时，超声波作用力度不够，造成提取不充分;随着超声功率的增加，对细胞破壁作用增强，细胞破裂程度大，胞内蛋白释放出来。但当超声波功率过大时，空化泡在声波膨胀相内来不及发生崩溃，太高的声强产生的大量空泡通过反射声波而减少了能量的传递。另外，当超声波功率较大时会使其他物质溶出，阻碍蛋白质溶出［12］。因此超声波功率继续增大时，蛋白质提取率反而有所下降。

图1 超声功率对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on protein extraction rate

2.1.2 超声温度对蛋白提取率的影响

不同超声温度对金针菇菌根蛋白提取率的影响试验结果见图2。由图2 可以看出，蛋白提取率随着超声温度的增加而增大，在30℃时达到最大，之后随温度上升提取率反而下降。温度升高、分子之间热运动加剧，促使提取过程中传质速率上升，提取速率加快。在温度相对较低的情况下，超声空化作用能促使金针菇组织中蛋白最大限度溶出。另一方面，提取时蒸汽压随温度的升高而上升，这将导致空化强度或空化效应下降［13］，从而不利于提取过程的强化，故当温度超过某一限度后，提取率反而下降。

图2 超声温度对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on protein extraction rate

2.1.3 超声时间对蛋白提取率的影响

不同超声时间对金针菇菌根蛋白提取率的影响试验结果见图3。超声波通过波源的振荡作用，使提取物的外表收到机械损伤和破碎，使溶胀的时间大大地减少。由图3 可以看出前20 min 提取率迅速增加，这主要因为超声空化作用能使蛋白在较短时间内最大限度溶出，之后提取率随时间的延长而降低，可能是因长时间超声空化作用导致蛋白变性［14］，使提取率呈下降趋势。从经济实用的角度考虑，选取20 min 作为后续的提取时间。

图3 超声时间对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on protein extraction rate

2.1.4 超声材料对蛋白提取率的影响

不同质地的材料对金针菇蛋白的超声波提取也有着很大的影响。选定实验室常用的塑料、玻璃这2种材料的容器，并且底面积和高度都相似的250 mL烧杯作为容器进行实验，。不同材料对蛋白提取率的影响试验结果见图4。由图4 可以看出，用塑料杯的容器的蛋白提取率高，效果优于玻璃杯容器，且两者之间差异显著(P ＜0.05)。推测原因是烧杯的材质对超声波的空化作用和能量的反射与吸收作用有一定的影响，从而影响到了超声效果［15］。其作用机理目前还不清楚，有待深入去研究。

图4 超声材料对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic material on protein extraction rate

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归方程的建立与方差分析

根据单因素试验结果，以超声功率、提取温度、时间为自变量，蛋白提取率为响应(y)，自变量因素及编码水平见表2，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 设计三因素三水平试验，试验方案及结果见表3。

表2 试验因素水平及编码表Table 2 Variables and experimental design levels for response surface

表3 响应曲面试验设计及结果Table 3 Experimental designs and extraction results

对表3 中的试验结果进行回归分析，得到金针菇根蛋白提取率(Y)与超声功率(A)、超声温度(B )和超声时间(C )3 个因素的数学回归模型:

Y= +72.78 +1.21 A -1.50B -0.70C -3.29AB+1.92AC+0.23BC -3.52A2-9.21B2-3.31C2。对该模型进行显著性检验，回归模型系数显著性检验，结果见表4。

表4 回归模型的方差分析Table 4 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

由表4 可知，该模型的F 值为11.38，表明该模型有意义且达到极显著水平(P ＜0.01)。其中决定系数R2为0.936 0，说明该模型的拟合性较好，可用此模型对蛋白的提取率进行预测和分析。其中其信噪比大于4 即可认为该模型可用，而本模型的信噪比达到8.892，说明该模型可以在生产当中应用。

分析回归模型系数显著性得知AB，A2，B2，C2这几项为显著性的模型项。由F 检验可以得到因子贡献率为:B ＞A ＞C，即温度＞功率＞时间。

2.2.2 单因素效应分析

为进一步分析试验中各因素对蛋白提取率的影响，对回归模型进行降维处理。固定任意2 个因素于零水平，依次得到各个单因素与蛋白提取率的效应方程，根据方程可得到单因素效应曲线如图5。

图5 单因素效应分析图Fig.5 Domino effect analysis of single factor

由图5 可知，各因素对蛋白提取率的影响均呈先增大后减小的趋势，其中B 超声温度变化幅度最大，说明超声温度对蛋白提取率影响最大。图中各曲线的变化趋势与前面单因素试验结果基本吻合，说明所建立的数学模型是合适的。

2.2.3 交互作用分析

由方差分析结果可知，模型中AC，BC 无明显的交互作用，AB 的交互作用显著，即超声功率和温度之间的交互作用对蛋白提取率有显著影响，其交互作用响应曲面和等高线如图6 所示。

由图6 可以得出，在超声功率与温度对总蛋白提取率的交互影响中，一定的超声功率下，随着提取温度的升高，蛋白的提取率明显增大，在30℃达到最大值后随温度升高降低。而一定的提取温度下，随着提取功率提高能缓慢增加总蛋白的提取率，从图6 还可以看出，椭圆形明显，说明二者的交互作用显著。

2.2.4 回归模型验证

图6 超声功率和温度交互影响蛋白质提取率的曲面图及等高线图Fig.6 Response surface plot and contour plot of the effect of ultrasonic power and temperature and their mutual interactions on the extraction rate of protein

由Design-Expert.8.05b 软件对试验模型进行典型性分析以得到提取金针菇菌根蛋白的最佳条件为:功率124.33W;温度29.40℃;时间19.76 min 能获得最佳提取率的理论值为73.02%。采取上述最优条件进行试验，同时考虑到实际操作的情况，将蛋白提取条件修正为料液超声功率120W、温度30℃、时间20 min，实测提取率为73.22%，相对偏差0.27%，可见该模型能较好地反映金针菇菌根蛋白质提取条件。

3 结论

本试验采用超声波辅助碱提法提取金针菇菌根蛋白。超声条件对菌根蛋白的提取率有明显的影响，提取因子贡献率为温度＞功率＞时间。由回归模型得出超声辅助提取的最佳工艺条件为功率124.33W，温度29.40℃，时间19.76 min，能获得最佳提取率的理论值为73.02%，通过验证实验实际提取率为73.22%，相对偏差为0.27%，证实了该模型的可靠行性，为金针菇根蛋白的提取提供了理论依据。

为了充分开发利用金针菇废弃菌根，有效提高金针菇下脚料的价值仍需加大科研力度，完善蛋白提取分离的理论和方法，满足工业产业化生产的要求。采用超声辅助提取金针菇根蛋白具有操作简单，时间短，提取率高，能耗低等优点，可以广泛用于工业上蛋白的生产。

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