UFLC-MS/MS法测定氨茶碱制剂中的氨茶碱含量Δ

张娟红，王荣，谢华，贾正平，，李文斌，谢希晖，（.兰州军区兰州总医院全军高原损伤防治重点实验室，兰州 730050；.兰州大学药学院，兰州 730050）

氨茶碱为茶碱和乙二胺的复合物，主要用于支气管哮喘和喘息性支气管炎，与受体激动药合用可提高疗效。虽然许多新的抗哮喘药物不断涌现，但是氨茶碱仍是当今最广泛使用的抗哮喘药物之一。其还可用于治疗急性心功能不全和心源性哮喘、胆绞痛[1-2]，近年来还发现氨茶碱对急性缺氧动物吸氧后再缺氧损伤有预防作用[3]。

目前，氨茶碱含量测定方法主要有高效液相色谱（HPLC）法[4-5]、毛细管电泳（CE）法[6]、拉曼光谱法[7]等。《中国药典》2010年版[8]收载了氨茶碱片剂、注射剂及缓释片的含量测定方法为紫外分光光度（UV）法，但此方法存在分析时间长、灵敏度低、辅料干扰多等缺点。随着液相色谱质谱联用技术的逐步推广，建立氨茶碱不同剂型超快速液相色谱串联质谱联用（UFLC-MS/MS）法用于其质量控制有着重要的意义。本试验通过优化色谱和质谱条件建立了测定氨茶碱制剂含量的UFLC-MS/MS法，该方法缩短了分析时间，大大提高了分析工作效率，尤其可能适用于微量样品的分析，比如可用于药动学的研究。

1 材料

UFLC仪（日本岛津公司）；API 3200三重四极杆串联质谱仪（美国AB公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声波清洗器（奥特赛恩斯仪器有限公司）；涡旋混匀器（金坛市金城教学仪器厂）。

氨茶碱标准品（中国食品药品检定研究院，批号：0844-9802，纯度：供含量测定用）；氨茶碱片（山西云鹏制药有限公司，批号：B110101、A100302、A101002，规格：每片0.1 g）；氨茶碱注射液（上海现代哈森药业有限公司，批号：10091612，规格：2 ml∶0.25 g；山西晋新双鹤药业有限公司，批号：1005161，规格：2 ml∶0.25 g；常州兰陵制药有限公司，批号：1010202，规格：10 ml∶0.25 g；河南润弘制药股份有限公司，批号：1011231，规格：2 ml∶0.25 g）；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，水为灭菌注射用水。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件的建立

色谱柱：Shim-pack XR-ODS（75 mm×3.0 mm，2.0 μm）；流动相：乙腈-0.4%甲酸水溶液（54∶46，V/V），流速：0.40 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μl；整个分析流程用时3 min。

质谱采用电喷雾离子源（ESI）正离子多反应（MRM）方式检测；氨茶碱在ESI源正离子电离方式下，有较好的质谱响应，主要生成[M+H]+离子峰，为m/z181.0；喷雾电压（IS）：4 500 V；雾化温度（TEM）：450℃；氨茶碱检测离子对m/z181.0→124.0；碰撞诱导解离电压（DP）：35 psi；碰撞能量（CE）：25 psi。选择性对[M+H]+离子进行碎片质谱分析得相应的二级扫描质谱图，见图1。

2.2 方法的专属性

在“2.1”项色谱条件下，分别取空白溶液（流动相）、“2.3”项下标准品溶液与供试品溶液（片剂，批号：B110101）进样测定，得到特征峰。结果，氨茶碱保留时间附近未见杂质峰，说明辅料对测定无干扰，详见图2。

图1 氨茶碱扫描质谱图A.母离子；B.碎片离子Fig1 MS/MS spectra of aminophyllineA.parent ion；B.fragment ion

图2 超快速液相色谱串联质谱图A.空白溶液；B.标准品溶液；C.供试品溶液；1.氨茶碱Fig 2UFLC-MS/MS chromatogramsA.blank solution；B.standard solution；C.test sample solution；1.aminophylline

2.3 溶液的制备

标准品溶液：精密称取氨茶碱标准品0.002 0 g于10 ml量瓶中，加入灭菌注射用水溶解并定容，得质量浓度为200 μg/ml氨茶碱标准溶液作为贮备液；将贮备液依次用流动相稀释成质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/ml的系列标准品溶液。

供试品溶液：取氨茶碱片20片，精密称定，研细。精密称取适量（约相当于氨茶碱50 mg），置于200 ml量瓶中，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液10 ml与水30 ml，振摇10 min使氨茶碱溶解，用水稀释至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液20 μl，置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取氨茶碱注射液适量，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液定量稀释制成每1 ml中约含氨茶碱100 μg的溶液。精密吸取溶液50 μl，置于100 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

供试品溶液进样前于10 000 r/min离心3 min，吸取上清液于进样瓶中待测。

2.4 标准曲线的制备

取“2.3”项下氨茶碱系列标准品溶液进样分析，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得方程Y＝353X+1.1×103（r＝0.999 8），权重：1/x2。结果表明，氨茶碱检测质量浓度线性范围为0.25～100 ng/ml，最低定量限为0.25 ng/ml。

2.5 精密度试验

取一定量的氨茶碱标准品贮备液用甲醇稀释成质量浓度为0.3、50、85 ng/ml的质量控制（QC）样品各5份，进样分析，计算得日内RSD分别为2.45%、1.85%、0.90%；取上述浓度的QC样品连续测定3 d，得日间RSD分别为2.84%、1.91%、1.13%。RSD均≤2.84%，符合制剂分析的方法学要求。

2.6 重复性试验

精密称取同一批氨茶碱片5份，按“2.3”项下方法平行制备5份供试品溶液，进样分析，结果含量的RSD＝1.11%，表明本方法有较好的重复性。

2.7 回收率试验

取已知含量的氨茶碱供试品溶液（片剂，批号：B110101）0.5 ml共5份，分别加入100 ng/ml的氨茶碱标准品溶液10、25、50、100、200、500 μl，涡旋混匀后进样分析，计算回收率。结果氨茶碱回收率分别为99.10%、99.50%、99.29%、100.29%、99.66%、100.64%，平均值为99.75%，符合要求。

2.8 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于制备后0、6、24 h后依法测定，结果，峰面积的RSD＝1.67%，表明供试品溶液于室温下放置24 h稳定。

2.9 2种氨茶碱制剂含量测定结果

按“2.3”项下方法制备不同批号氨茶碱供试品溶液，进样分析。结果不同厂家的药品含量测定结果均符合《中国药典》要求，但不同剂型的氨茶碱含量有一定差异，详见表1。

表1 7批氨茶碱制剂含量测定结果（n＝3）Tab1 Content determination of aminophylline in 7 batches ofAminophylline preparation（n＝3）

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本试验前期考察了流动相中不同体积分数（0.2%、0.3%、0.4%）的甲酸水溶液对氨茶碱检测的影响，发现当甲酸体积分数为0.4%时，氨茶碱峰形、响应值和分析时间均较好，所以选择以乙腈-0.4%甲酸水溶液（54∶46，V/V）为流动相，同时检测限更低。

3.2 质谱条件的选择

选用1 μg/ml氨茶碱标准品溶液进行质谱条件的选择，以ESI+作为电离模式，氨茶碱有较好的质谱响应，且分别对IS、DP、TEM、CE等质谱参数进行了优化，使得质谱扫描达到最佳，以便检测，最终确立了“2.1”项下的各项质谱条件为最优。

虽然已有报道采用HPLC法、UV法测定氨茶碱制剂含量的方法，但目前尚未见采用UFLC-MS/MS法测定氨茶碱制剂含量的文献报道。本试验方法具有简单可靠、准确灵敏、快速高效的优点，并且重复性好，辅料未见干扰。

研究结果发现，不同剂型的氨茶碱含量有一定差异，故建立氨茶碱质量控制的UFLC-MS/MS方法具有重要意义，本方法氨茶碱定量限为0.25 ng/ml，适用于少量样品及生物样品的分析，与已有报道的HPLC法、UV法相比，本方法更加灵敏、准确、专属性好，减少了操作误差，且取样量少，适用于氨茶碱制剂的含量测定，同时也可能适用于血样等生物样品的分析。

[1]陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学[M].17版.北京：人民卫生出版社，2011：446.

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[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：836-837.