高效液相色谱法测定婴幼儿乳制品中免疫球蛋白IgG的含量

高 旭 ，郑永杰 ，谭阳阳，郭 岩

（1.齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔市质量检测中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.牡丹江出入境检验检疫局，黑龙江 牡丹江 157021；4.哈尔滨工业大学 理学院，黑龙江 哈尔滨 150001）

免疫球蛋白（IgG）是一种具有抗体活性的球蛋白。IgG不易被胰蛋白酶水解，可以直接渗透肠壁进入血液，因此，IgG对婴儿的胃肠道具有保护作用[1-3]。国内外IgG的检测方法有：酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、免疫胶体金法、免疫扩散法、免疫比浊法、免疫电泳法、毛细管电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。其中高效液相色谱法具有灵敏度高，分析速度快，检出限低等特点。本实验是对高效液相色谱测定婴幼儿乳制品中免疫球蛋白IgG含量的方法进行优化。分别对流速、柱温、流动相的pH值、检测波长等因素进行优化，确定最佳的IgG的液相色谱条件。

1 实验部分

1.1 实验材料

KH2PO4、K2HPO4、甘氨酸、HCl、H3PO4、NaOH、乙腈（色谱纯）、乙醇（色谱纯）、婴幼儿乳制品、IgG标准品（美国Sigma公司）。

高效液相色谱仪HP1100(美国安捷伦公司)；Hi-Trap protein GHP色谱柱（1 mL美国安捷伦公司）；Venusil XBP-NH2氨基柱（5μm，100Å，4.6×250mm日本岛津GL公司）；Hjchrom Wonbasil C18柱（5μm，4.6×250mm美国安捷伦公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 IgG标准储备液：精确称取25mg IgG标准品，用0.05mol·L-1磷酸盐缓冲溶液（pH值为6.5）稀释到25mL，得到的IgG标准储备液浓度为1.0mg·mL-1。并用0.05mol·L-1磷酸盐缓冲溶液（pH值为6.5） 将其稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的标准溶液。

1.2.2 样品前处理 称取婴儿配方奶粉2g，用0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液溶解，涡旋5min，8000r·min-1、4℃下离心30min去除脂肪，取脱脂乳，用乳酸调pH值至4.6，超声后8000r·min-1、4℃下离心40min，去除剩余的油脂和蛋白，取上清液，过0.45μm微孔滤膜待测。

1.2.3 色谱条件 本实验分别使用 C18柱、XBP-NH2氨基柱和Hi-Trap protein GHP1mL色谱柱对IgG进行分析。Hjchrom Wonbasil C18柱和Venusil XBP-NH2氨基柱所用流动相为0.05mol·L-1、pH值6.5的磷酸盐缓冲溶液（PBS）和乙腈（95:5）；流速1.0mL·min-1；检测波长280nm；进样量20μL；柱温25℃。使用Hi-Trap protein GHP1mL色谱柱分析时，流动相A：0.05mol·L-1磷酸盐缓冲溶液（pH值6.7），流动相B：0.05mol·L-1甘氨酸盐缓冲液（pH值2.7）；流速0.4mL·min-1；检测波长280nm；进样量20μL；柱温25℃，按表1的梯度条件进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

使用二级管在200～400nm波长范围内对IgG标准品进行全光谱扫描，如图1所示，免疫球蛋白IgG标准品在220nm和280nm处均有强吸收峰，一般物质在220nm处都有吸收，干扰较大。因此，确定其检测波长为280nm。

图1 IgG 标准品扫描光谱图Fig.1 Scan spectrum diagram of IgG standard product

2.2 色谱柱的选择

分别用Hjchrom Wonbasil C18柱、Venusil XBPNH2氨基柱及Hi-Trap protein GHP 1mL色谱柱对IgG标准品进行定性定量分析，通过判断其响应值的大小及分离效果，确定最终检测所用的分离柱。

用Hjchrom Wonbasil C18柱对免疫球蛋白IgG标准系列进行检测时，没有找到IgG的目标峰；用Venusil XBP-NH2氨基柱对免疫球蛋白IgG标准系列进行检测，虽确定了IgG的目标峰，但响应值极小，当进样浓度为1.0mg·mL-1时，其响应值不足10mAU，并且分离效果也非常不好；而用Hi-Trap protein GHP 1mL色谱柱对免疫球蛋白IgG标准系列进行检测时，其分离效果、色谱峰形及响应值均可达到满意效果，在此色谱条件下的IgG标样色谱图见图2，图中保留时间tR=11.352的峰为IgG目标峰。因此，选择Hi-Trap protein GHP 1mL色谱柱为检测婴幼儿乳制品中免疫球蛋白IgG含量的分离柱。

图2 IgG 标准品色谱图Fig.2 HPLC of IgG standard product

2.3 流速的选择

在流速为0.2、0.4、0.6mL·min-1条件下分别对0.2mg·mL-1IgG标准液进行检测，流速对峰面积影响见表2。

表2 流速选择对峰面积影响Tab.2 Influence of the flow rate selection for peak area

从表2中得出，流速对峰面积的影响较小，随着流速的增大峰面积稍有减小的趋势，流速从0.2 mL·min-1变到0.6mL·min-1，峰面积仅减小3.9 mAU。但在色谱分析中，在不超过柱压和满足分离要求的同时，应尽量选择稍大的流速。此柱所能承受的柱压上限10bar，当流速为0.6mL·min-1时超过此柱柱压上限。因此，选择0.4mL·min-1作为Hi-Trap protein GHP1mL色谱柱检测时的最佳流速。

2.4 柱温的选择

在柱温为25、30、35、45℃条件下分别对0.2mg·mL-1IgG标准液进行检测，柱温对峰面积影响见表3。

表3 柱温选择对峰面积影响Tab.3 Influence of the column temperature selection for peak area

从表3中得出，当柱温在25～35℃范围内，峰面积随柱温的升高稍有增加，但当超过35℃以后，峰面积呈减小趋势。主要原因是：当温度超过35℃以后，纯度较高的免疫球蛋白IgG的热稳定性将会降低，将有少量IgG会失活，最终导致峰面积减小。在室温条件下操作就能得到响应值较大目标峰峰值。因此，选择25℃作为Hi-Trap protein GHP 1mL色谱柱检测时的最佳柱温。

2.5 流动相p H 值的选择

Hi-Trap protein G HP 1mL色谱柱的填料为蛋白GSepharose HP，首先固定洗脱液B（0.05mol·L-1甘氨酸盐缓冲液）pH值，依次调结合液A（0.05mol·L-1磷酸盐缓冲液）pH值为6.1、6.3、6.5、6.7、6.9，然后固定结合液A的pH值，依次调洗脱液B的pH值为2.1、2.3、2.5、2.7、2.9，分别在设定条件下对1.0mg·mL-1IgG标准液进行检测。结合液pH值与其峰面积的关系见表4。洗脱液pH值与其峰面积的关系见表5。

表4 结合液pH 值选择对峰面积影响Tab.4 Influence of the pH of combined liquid selection for peak area

由表4得出，在pH值为6.7时，IgG目标峰峰面积最大，说明其结合能力最强。主要原因是：当洗脱能力相同时，结合力越强，结合的IgG量越多，则洗脱下来的IgG量就越多，响应值越大。因此，选择pH值为6.7的0.05mol·L-1的磷酸盐缓冲液为Hi-Trap protein GHP1mL色谱柱的结合液。

表5 洗脱液pH 值选择对峰面积影响Tab.5 Influence of the pH of eluent liquid selection for peak area

由表5得出，在pH值为2.7时，IgG目标峰峰面积最大，说明其洗脱能力最强。主要原因是：当结合能力相同时，结合的IgG量相同，洗脱力越强，洗脱的IgG量越多，响应值越大。因此，选择pH值为2.7的0.05 mol·L-1甘氨酸盐缓冲液为Hi-Trap protein GHP1 mL色谱柱的洗脱液。

3 结论

本实验主要对免疫球蛋白IgG的高效液相色谱法进行了优化，并建立了婴幼儿乳制品中的IgG提取的前处理方法。实验对色谱条件中所用的分离柱进行了对比选择，对所选用的分离柱的流速、柱温及流动相pH值进行了优化。最终确定最佳色谱条件为：Hi-Trap protein GHP 1mL色谱柱，检测波长280 nm，流速0.4mL·min-1，柱温25℃，结合液A为pH值为6.7的0.05mol·L-1的磷酸盐缓冲液，洗脱液B为pH值为2.7的0.05mol·L-1的甘氨酸盐缓冲液。

［1］郑峥，马彦科.牛初乳的开发利用及研究进展［J］.生物技术通讯，2010，（4）:746-748.

［2］马艳丽.牛初乳的营养保健功能及开发利用［J］.中国食物与营养，2011，（8）:182-187.

［3］徐丽.牛初乳中免疫球蛋白的提取与活性保持技术研究［D］.北京:中国农业大学硕士学位论文，2005.1-7.