PMA在RT-PCR检测药品细菌污染中的应用

应国红，王晓冲，李 军，王晓炜*，周继昌

（1.深圳药品质量标准研究重点实验室，深圳市药品检验所，广东 深圳 518000；2.深圳市慢性病防治中心，广东 深圳 518000）

注射用药品、生物制品中细菌污染可致患者出现热原反应，严重会引起脓毒血症、败血症、内毒素中毒甚至死亡。随着分子生物学发展，国内外学者将实时荧光定量PCR技术（RTPCR）引入微生物检测中，缩短检测时间，提高灵敏度[1-2]。然而，此法缺点是不能区分所检测到细菌是活细胞还是死细胞，样品中死菌及基因组会产生干扰，导致假阳性结果，造成实际应用困难。

叠氮溴化丙锭（PMA）是一类对DNA具有高度亲和力光敏DNA染料，经PMA前处理后样品暴露于强光下时，PMA与DNA分子共价结合，阻断DNA分子PCR扩增[3]。利用PMA特性，将PMA与实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术相结合，能够选择性抑制药品中死菌DNA扩增，有效避免假阳性结果。目前，关于PMA与RT-PCR相结合检测活菌报道很少，多集中于某种单一致病菌[4-5]，在实际应用中，样品中可能含有不同种类死菌，不同种类微生物因其细胞膜及细胞壁结构差异，最适宜PMA浓度不同，本研究将PMA与RT-PCR相结合，以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌分别做为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌为考查对象，在证实PMA区分死菌/活菌能力基础上，研究PMA可同时抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌死菌DNA PCR扩增最佳浓度、曝光时间，从而建立一种快速、有效区分药品中死/活细菌方法，应用于药品中污染细菌PCR检测。

1 材料与方法

1.1 菌株

金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003-5a9，大肠埃希菌CMCC（B）44102-3a8，均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 试剂与仪器

细菌裂解试剂盒（购自TAKARA大连宝生物公司）；PMA（规格：1 mg，纯度＞99%，购自美国Sigma公司）；Taqman荧光定量PCR试剂（购自TA⁃KARA大连宝生物公司）；LightCycler®480型实时荧光定量PCR仪（购自德国Roche Diagnostics公司）；电泳仪（购自美国Bio-Rad公司）；3K15型超速冷冻离心机（购自德国SIGMA公司）；500W卤钨灯（购自佛山电器照明股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 活菌和死菌悬液制备

分别挑取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌单菌落接种于10 mL营养肉汤中37℃，培养16 h，高速离心（8 000 r·min-1，4℃，5 min）收集菌体沉淀，经0.85%灭菌生理盐水洗涤2次后，重悬于生理盐水中。取定量菌悬液梯度稀释，测定每个梯度OD600mm并涂布营养琼脂平板，37℃恒温培养48 h后测定活菌数，以活菌数（x轴）和OD600mm值（y轴）做标准曲线，在本试验中，以此标准曲线调整菌液浓度。3次独立实验，每次重复3次。

取上述经洗涤大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌悬液，调整浓度至4×107cfu·mL-1制成活菌悬液，再取部分活菌悬液95℃水浴10 min，制成死菌悬液。另外，将死菌悬液在营养琼脂平板上划线，于37℃培养48 h，以验证灭活效果。

1.3.2 样品PMA处理方法

PMA溶解于二甲亚砜中，配制成0.5 mg·mL-1PMA母液（-20℃避光保存）。在样品中加入所需浓度PMA，室温避光处理10 min，然后将离心管开盖放置冰上，在距离卤素灯管16 cm处曝光5 min。曝光后混合菌悬液12 000 r·min-1离心5 min，收集菌体，倒掉上清液，再次重悬于100 μL生理盐水中（未加入细菌生理盐水0.5 mL作为阴性对照），应用裂解试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取DNA。抽提步骤：12 000 r·min-1，离心10 min，小心吸弃上清，加入50 μL裂解液，吹打均匀，80℃热变性15 min后，低速离心1 min，取5 μL裂解后上清液作为PCR反应模板进行RT-PCR扩增。

1.3.3 抑制死菌RT-PCR反应最小PMA浓度确定

在0.5 mL大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌死菌悬液（4×107cfu·mL-1）离心管中加入一定量PMA母液（0.5 mg·mL-1），使其终浓度分别为 0.0、0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 μg·mL-1，另取一只离心管加入0.5 mL灭菌生理盐水，不加PMA作为阴性对照，再按2.2方法进行样品处理，考察抑制死菌RT-PCR反应最小PMA浓度。

1.3.4 不抑制活菌RT-PCR反应最大PMA浓度确定

在含有0.5 mL大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌活菌悬液（4×107cfu·mL-1）离心管中加入一定量PMA 母液（0.5 mg·mL-1），使其终浓度分别为0.0、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0 和 40.0 μg·mL-1，再按2.2方法进行样品处理，考察不抑制活菌RT-PCR反应最大PMA浓度。

1.3.5 最佳PMA交联曝光时间确定

在0.5 mL大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌死菌悬液（4×107cfu·mL-1）离心管中加入一定量PMA母液（0.5 mg·mL-1），使其终浓度为 5 μg·mL-1，用500 W卤素灯以曝光时间0、1、2、3、4、5、10、20 min进行PMA交联，获取适宜PMA交联曝光时间。

1.3.6 死/活细胞混合菌悬液PMA RT-PCR扩增

取完全相同2组离心管，分别加入0.25 mL固定数量（2×107cfu·mL-1）金黄色葡萄球菌死菌悬液与0.25 mL变化数量（2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2 ×102、2× 101和0 cfu·mL-1）金黄色葡萄球菌活菌悬液，混合均匀。一组加入0.5 mg·mL-1PMA，使PMA终浓度达到5 μg·mL-1，按2.2方法进行样品处理，进行PMA RT-PCR；一组不加PMA直接提取基因组DNA进行常规RT-PCR。另取1组离心管，分别加入0.25 mL去离子水与0.25 mL 变化数量（2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2 ×102、2× 101和0 cfu·mL-1）金黄色葡萄球菌活菌悬液，混合均匀，提取基因组DNA，进行RT-PCR作为对照。

1.3.7 引物及RT-PCR扩增

试验采用实时荧光定量PCR仪，利用细菌16S rRNA基因通用引物[6-7]，上游引物：5'TCC TACGGGAGGCAGCAGT 3'，下游引物：5'GGAC⁃TACCAGGGTATCTAATCCT 3'，探针：FAM-5'CG⁃TATTACCGCGGCTGCTGGCAC 3'-TAMRA。PCR反应体系：反应体系25 μL，引物和探针（由英潍捷基合成）终浓度为0.2 μmol·L-1，dNTP终浓度为200 μmol·L-1，Mg2+终浓度 2.5 mmol·L-1，Hot Ex TaqHS 0.05 U，然后加入5 μL DNA模版。PCR反应条件：预变性（95℃，30 s）；扩增（95℃ 5 s，60℃1 min，40 cycles）。每个RT-PCR反应重复3次，得到平均Ct值和标准背离值。所得数据以“平均值±标准差”表示，应用SPSS 11.5统计软件对数据进行t检验，P＜0.05表示具有差异显著性。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测体系中PMA浓度优化

由表1可知，当PCR反应体系中PMA浓度≤1 μg·mL-1时，PMA对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌死菌DNAPCR扩增没有显著影响，而当PMA浓度达到3.0 μg·mL-1时，大肠埃希菌Ct值与PMA终浓度0.0 μg·mL-1比差异显著（P＜0.05），证明PMA能有效抑制大肠埃希菌死菌DNAPCR扩增；当PMA浓度达到5.0 μg·mL-1时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌Ct值与PMA终浓度0.0 μg·mL-1比均差异显著（P＜0.05），证明PMA能同时有效抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌死菌DNAPCR扩增，在该浓度下，RT-PCRCt值与阴性对照相差不大，无显著差异（P＞0.05），说明样品中死菌DNAPCR扩增被完全抑制。当继续增加PMA浓度时，其抑制效果没有明显提高，因此，能同时抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌死菌DNA PCR反应最小PMA浓度为 5.0 μg·mL-1。当PMA浓度小于20 μg·mL-1时，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌活菌PCR扩增影响较小，这与报道同类物质EMA不抑制活菌PCR反应最大浓度5和3 μg·mL-1差别较大[4-5]，这是由于EMA对活细胞有毒性，具有较高细胞膜透性，能穿过细菌活细胞完整细胞膜与DNA交联[3,8]，使其应用受到较大限制。

表1 PMA使用浓度优化Table 1 Optimization of PMA concentration

2.2 PMA处理最佳曝光时间

光照时间对活菌检测准确率具有重要影响，光照时间不足，PMA不能完全分解，在后续提取过程中会与裂解活菌DNA分子结合，使PCR反应受到影响。热致死大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌悬液（4×107cfu·mL-1）分别经PMA（终浓度 5 μg·mL-1）处理后，曝光1～20 min，结果如图1所示。曝光时间超过5 min后，PMA对RT-PCR Ct值影响随时间增加变化不明显，说明光照5 min，可使加入PMA分子全部分解。

图1 曝光时间对PMA处理死细胞影响Fig.1 Effect of light exposure time on PMA treatment of dead cells

2.3 PMA RT-PCR对活菌/死菌混合物检测

如图2所示，常规RT-PCR反应由于无法区分死活菌，混合体系中DNA含量相对固定，因此其Ct值变化不大；经过PMA处理混合液，PMA与死菌基因组DNA共价结合，阻止这部分基因组DNA扩增，PCR反应Ct值与活菌对照接近，证明PMA能特异性地抑制混合体系中死菌扩增，而对活菌扩增几乎没有影响。

图2 PMA RT-PCR对不同比例活细胞/死细胞混合样品检测Fig.2 Detection for mixed bacteria by PMA RT-PCR

3 讨论与结论

PMA能渗透到细胞壁或细胞膜不完整死细胞内与基因组DNA共价结合，阻止其DNA PCR扩增；而活细胞完整细胞壁、活细胞膜能够阻止PMA渗透到菌体内与DNA共价结合，因而其PCR扩增不受影响。PMA这种性质为PCR检测区分样品中死活菌提供可靠依据[3,8]。目前，PMA与PCR、Real-time PCR等技术结合，已经被用于副溶血弧菌、军团杆菌、沙门氏菌等病原菌检测[9-12]，来减少样品中死菌干扰，避免假阳性结果。

本研究PMA对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌死菌抑制作用，发现在样品前处理过程中加入终浓度为5 μg·mL-1PMA，能有效抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌死细（4×107cfu·mL-1）扩增；而当PMA浓度小于或等于20 μg·mL-1时，对活菌PCR扩增没有显著影响。另外，在金黄色葡萄球菌活菌/死菌混合体系中，由于在活菌/死菌比例不同混合组中，DNA含量相对变化不大。因此，常规RT-PCR反应Ct值变化不大；而加入PMA预处理后，RT-PCR反应Ct值与每个PCR反应体系中所存在活菌数对数值呈现线性关系，证明PMA能特异性地抑制混合体系中死菌扩增。

应用本研究建立的PMA前处理方法，能抑制革兰氏阳性及阴性菌PCR过程中死菌DNA扩增，弥补常规PCR无法区分样品中活菌/死菌这一技术不足，降低PCR检测过程中由于死菌造成假阳性结果风险，对于可能混有多种细菌污染药品PCR检测，具有很好应用前景。

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