正交试验法优选丁香叶中总黄酮提取工艺

陈雪英，霍金海，刘芳萍*

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省中医研究院，哈尔滨 150036）

丁香叶为木樨科植物紫丁香（Syringa oblateLindl）、洋丁香（S.vulgarisL.）和朝鲜丁香（S.dila⁃tataNakai）干燥叶，具有广谱抗菌和抗病毒作用。以其为原料生产炎立消胶囊、片剂（收载于中华人民共和国卫生部颁药品质量标准）用于治疗急性肠炎、菌痢、上呼吸道感染及急、慢性扁桃体炎等感染性疾病，疗效显著[1]。但该产品用一定量药材原粉入药，服用量大、溶散时限长短不一、生物利用度低，其提取工艺参数优化是需解决的关键问题之一。

目前关于丁香叶提取工艺文献报道较少[2-3]，其中黄酮类为其重要成分，丁香叶中黄酮提取液对白葡萄球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用[4]。丁香叶中黄酮类成分提取工艺研究常采用微波法[2]，该方法提取效率高、操作简便、省时、无污染，但微波萃取上还停留在实验室小样品提取及分析阶段，设备简陋，工业化微波提取器尚未见报道。

本文以丁香叶有效成分总黄酮为指标，对常用渗漉法、回流法、超声法进行考查，采用正交试验设计优选总黄酮提取工艺，为其生产工艺研究及深层次开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

6000PC型可见紫外分光光度计（购自上海元析仪器有限公司）；KQ-300DB型数控超声仪（购自昆山市超声仪器有限公司）；BP211D型电子天平（购自德国Sartorius公司）；DK-8D型电热恒温水槽（购自上海精宏试验设备有限公司）。

1.2 材料

芦丁对照品11040302，供含量测定用（由中国药品生物制品检定所提供）；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝，分析纯（购自国药集团化学试剂有限公司）；乙醇，分析纯（购自天津科密欧化学试剂有限公司）；丁香叶采自东北农业大学校内，经鉴定为木樨科植物紫丁香叶，置阴凉通风处干燥。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮含量测定方法

1.3.1.1 标准曲线制备

精密称取芦丁对照品50 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，得2 mg·mL-1对照品溶液。精密量取对照品溶液1、2、3、4、5与6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不含芦丁相应试剂为空白，照紫外可见风光光度法，在510 nm波长处测定吸光度。

1.3.1.2 样品含量测定

分别精密吸取样品溶液6 mL，按1.3.1.1条测定，并用回归方程计算总黄酮含量。

1.3.2 总黄酮提取方法考察

渗漉法：取丁香叶3 g，精密称定，置于内径为0.5 cm玻璃柱内，加60%乙醇浸泡2 h后，以1 mL·min-1度渗漉，共60 mL，收集渗漉液，混匀，精密吸取0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。测定并计算总黄酮含量。

回流法：取丁香叶3 g，精密称定，加60%乙醇60 mL，回流提取2 h，滤过，精密吸取续滤液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。测定并计算总黄酮含量。

超声法：取丁香叶3 g，精密称定，加60%乙醇60 mL，超声处理2 h，滤过，精密吸取续滤液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。测定并计算总黄酮含量。

1.3.3 单因素试验方法

1.3.3.1 乙醇浓度对总黄酮得率影响

精密称取5份质量为3 g丁香叶，分别加入60 mL 20%、40%、60%、80%、100%乙醇，回流提取2 h，滤过，精密吸取续滤液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。测定并计算总黄酮含量，研究不同乙醇浓度对总黄酮提取率影响。

1.3.3.2 液料比对总黄酮得率影响

精密称取5份质量为3 g丁香叶，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%乙醇溶液，回流提取2 h，滤过，精密吸取续滤液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。测定并计算总黄酮含量，研究不同液料比对总黄酮提取率影响。

1.3.3.3 提取时间对总黄酮得率影响

精密称取5份质量为3 g丁香叶，加入60%乙醇溶液60 mL，分别回流提取1、1.5、2、2.5、3 h，滤过，精密吸取续滤液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。测定并计算总黄酮含量，研究不同提取时间对总黄酮提取率影响。

1.3.4 正交试验方法

在单因素试验基础上，丁香叶以乙醇浓度A、液料比B、提取时间C为3个考察因素，每个因素选择3个水平，按L9(34)正交表设计4因素3水平正交试验（见表1）。

以总黄酮得率为考察指标，每次试验重复3次，取平均值作为结果，确定从丁香叶中提取总黄酮最佳工艺。

表1 正交因素水平Table 1 Factor levels of design in orthogonal test method

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线绘制

以吸光度值（A）为纵坐标，芦丁浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线（见图1），得回归方程：

y=13.004x-0.0086（r=0.9997）。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of Rutin

2.2 总黄酮提取方法考察结果与分析

以丁香叶总黄酮得率为指标，考察渗漉法、回流法和超声法3种不同提取方法对总黄酮得率影响（见图2）。

图2 提取方法对总黄酮得率影响Fig.2 Effect of the extraction method on total flavonoids yield

由图2可知，渗漉法提取效率较低，回流法和超声法提取效率均较高，说明加热和超声波辅助方式均能增加丁香叶中黄酮类物质溶出，本文选择回流法作进一步研究。

2.3 单因素试验结果与分析

2.3.1 乙醇浓度对总黄酮得率影响

以丁香叶总黄酮得率为指标，分别以20%、40%、60%、80%、100%乙醇回流提取，乙醇浓度对总黄酮得率影响见图3。

图3 乙醇浓度对总黄酮得率影响Fig.3 Effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

由图3可知，用浓度40%～80%乙醇提取总黄酮得率较高，而在乙醇浓度为20%及100%时，总黄酮得率较低。这可能是由于总黄酮包含黄酮苷及苷元两部分组成，20%乙醇对苷元溶解度较低，100%乙醇对黄酮苷溶解度较低，故选择乙醇浓度为40%～80%作进一步研究。

2.3.2 料液比对总黄酮得率影响

第二，依法严厉打击贪腐造假等不法行为以营造合法谋利的社会氛围，提供起点公平、程序公正、机会均等的竞争环境。当下中国，“漂族”、“蜗居”、“蚁族”人群大量出现，使人们不安全感加重；房难买、学难上、病难看的现实矛盾，让人的不确定感增强；而少数干部的贪污腐败、一些地方的暗箱操作，使干群关系变得紧张而不信任。［14］为什么这些现象难以消除并激化人心？就因为缺少一个合法谋利的社会环境及氛围。人人都想着如何参与财富的分配而不是财富的创造，则追求满足的行为很容易蜕变为贪腐造假的祸害。

以丁香叶总黄酮得率为指标，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%乙醇溶液回流提取，料液比对总黄酮得率影响见图4。

由图4可知，料液比1∶15～1∶25，总黄酮得率增加幅度最大，而料液比1∶30与1∶25相比，总黄酮得率增加幅度不大，均比料液比1∶10得率高。这是由于丁香叶质地蓬松，料液比1∶10溶媒较少，无法浸没药材，未能与乙醇接触完全，导致有效成分浸出不完全。而1∶30溶媒量较大，给后续回收工艺带来困难，故设定料液比为1∶15、1∶20、1∶25作进一步研究。

2.3.2 提取时间对总黄酮得率影响

以丁香叶总黄酮得率为指标，60%乙醇溶液分别回流提取1、1.5、2、2.5、3 h，提取时间对总黄酮得率影响见图5。

图4 料液比对总黄酮得率影响Fig.4 Effect of the material-liquid rate on total flavonoids yield

图5 提取时间对总黄酮得率影响Fig.5 Effect of the extraction time on total flavonoids yield

由图5可知，随着提取时间延长，总黄酮得率逐步提高，但3 h后，得率略有降低，是长时间回流对黄酮类成分产生影响，故选择提取时间1.5 h～2.5 h作进一步研究。

2.4 正交试验结果与分析

以总黄酮得率为考查指标，结果见表2，D项为空白项，作方差分析。对表2进行统计学处理并方差分析（见表3）。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

3 讨论与结论

天然黄酮类化合物提取方法包括溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、超临界流体萃取法等。在提取方法设计过程中，对各类方法优缺点进行充分考虑。溶剂提取法是目前黄酮类化合物常用提取方法，分为冷浸法、渗漉法、回流法。其中冷浸法效率较低，故本文考查渗漉法、回流法。

超声波提取操作简便、无需加热、提出率高、速度快，近年来在黄酮类化合物提取过程中，显示出明显优势，本文将其列为考查方法之一。微波提取法具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高特点，国内外学者对其在黄酮提取进行大量报道，但仅限于试验研究，其设备推广及产业化仍需进一步研究。

超临界流体萃取具有传质速度快、溶解能力强、低温操作、节能等优点，用该技术提取天然产物有效成分成为研究热点，由于产业化设备一次性投入昂贵，目前在我国中药制药企业实际应用较少。因此，本试验最终选择渗漉法、回流法、超声法进行研究。

在正交设计过程中，考虑到溶媒浓度、用量、提取时间、提取次数4个因素为影响溶液提取法主要因素。在文献报道中，可见部分试验采用L9（34）正交，4个因素全部安排在表中，将提取次数设为D项，影响较小，可近似替代随机误差项进行统计分析。将D项设为空白，在无处理因素下产生随机误差，作为各处理因素比对基准，试验设计更为严谨。提取次数一般与前3个因素无交互作用，可根据实际生产中含量、固形物得率等具体需求而设定。

本试验结果表明，乙醇回流法及超声法同样具有较高提取效率。因乙醇回流法是中药制剂生产中最常用提取方法，故本文对其进行进一步优化研究，超声法虽省时省力，节约能源，但不适合大生产，建议在实验室研究中采用。在本试验优化条件下，丁香叶总黄酮最高含量为118 mg·g-1，与文献[2]微波法提取结果有较大差异。原因可能除提取方法本身差异外，丁香叶产地，采集时间是影响试验结果主要因素，因此应进一步对不同产地、不同采集时期丁香叶进行系统品质评价研究，得出科学结论。

本研究选用乙醇回流法作为丁香叶提取方法，并采用正交试验法优化试验条件，提高丁香叶中总黄酮提取效率，含量达100 mg·g-1以上（相当于生药量），为提取丁香叶有效部位提供科学、可靠方法。此工艺符合制药企业生产实际情况，可推广、应用并改进，为丁香叶深层次开发利用提供参考。

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