寄主挥发物对青杨脊虎天牛EAG和行为的影响1)

李 玲 迟德富 裴永强 张 振 张 琦 王广利 李小灿

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

青杨脊虎天牛(Xylotrechus rusticus L.)属鞘翅目天牛科，是东北林区的主要蛀干害虫之一，其幼虫钻蛀树木的枝干或根部，使输导组织遭到破坏，影响树木正常生长发育，甚至导致树木风折死亡。目前利用一般的杀虫剂防治蛀干害虫很难达到理想的防治效果［1］。随着青杨脊虎天牛危害的不断加剧，对其进行有效地防控已迫在眉睫。研究表明，植物释放的特定挥发性气味物质能够诱导昆虫定位寄主、选择适宜的产卵场所或对植物产生逃避行为。如果没有植物气味的存在，多数植食性昆虫找到寄主植物的概率就会非常低，将直接影响这些种类昆虫的生存繁衍［2］。此外，植物挥发性气味组分可因植物的年龄、组织器官、生理状态等的不同而改变，从而引起昆虫的行为变化，有时微生物也参与其中。植物挥发性气味的组成常因遭受害虫的为害而改变［3］。所以利用植物源挥发性物质制备相应的引诱剂与驱避剂显得尤为重要。近年来，国内对鳞翅目昆虫感觉气味物质的行为化学模式的研究较多，以研究棉铃虫取食和产卵所感知的化学信息较为深入［4］，对鞘翅目天牛科昆虫寻找寄主的化学指纹图的研究也日渐兴起，但目前只是取得阶段性成果，对青杨脊虎天牛信息素和其寄主植物次生代谢产物的研究也渐趋深入［5－8］。笔者通过对青杨脊虎天牛蛀屑及被害的小青黑杨((P.pseudo-simonii×P.nigra))树皮挥发物质的鉴定，选择其中的6种单体化合物及其2种混合物来研究它们与青杨脊虎天牛寻找寄主的行为关系，以期为探寻青杨脊虎天牛的寄主定位机制和生产实践中的防治工作提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

青杨脊虎天牛成虫:2008年2月在哈尔滨市呼兰区，采集1～2 m长的携带青杨脊虎天牛幼虫的小青黑杨木段，并将木段两端用石蜡封好，防止木段中的水分蒸发。然后将木段置于养虫室内用纱网罩上进行培养。培养条件为:温度25～28℃;相对湿度50% ～70%;光照时间14 h/d。待成虫羽化后，每天8:00收集成虫。

虫蛀屑:试验分析所用的虫蛀屑包括前1 a危害的陈蛀屑和当年危害的新蛀屑。陈蛀屑的采集是根据成虫羽化孔位置寻找到危害部位，剥去前1 a危害部位的树皮，采集树皮下面的褐色至深褐色的虫蛀屑(代号为1)。新蛀屑的采集是拨开正被危害部位的杨树树皮，采集白色至淡黄色的虫蛀屑(代号为2)。

寄主树皮:取已经被害过的小青黑杨，且有羽化孔留在表面的树皮，去掉木栓层后留下的部分(代号为3)。

1.2 仪器设备

水蒸气蒸馏装置;旋转蒸发仪(RE－52B);HP6890/5973型气相色谱—质谱联用仪(GC－MS)(Agilent公司);荷兰Syntech公司触角电位仪;“Y”形双向选择嗅觉仪(自制)。

1.3 所用试剂

二氯甲烷、正己烷和乙醚均为分析纯。供试的6种挥发性物质和2种混合物(表1)均配制成10－5、10－4、10－3、10－2、10－1、1 g·L－16 个梯度。

表1 供试挥发物的名称、纯度、溶剂及来源

1.4 挥发物提取方法

直接浸提法:参照水浴浸提法［9－10］，浸提试剂由95%乙醇改为二氯甲烷、在室温下浸提。将陈蛀屑、新蛀屑和树皮各10 g分别装入250 mL的三角瓶中，用150 mL二氯甲烷浸提24 h后过滤得Z1、Z2和Z33种提取液。另取10 g陈蛀屑用150 mL乙醚直接浸提得 Y1。

26℃水浴浸提法:参照水浴浸提法［9］。浸提试剂由95%乙醇改为水、在26℃水浴中浸提。将陈蛀屑、新蛀屑和树皮各10 g分别装入250 mL的三角瓶中，各加水250 mL，放入26℃水浴中浸提24 h后过滤得到3种粗提液，将3种粗提液分别用120 mL的二氯甲烷萃取，每次30 mL，萃取4次，得到E1、E2、E3提取液。

水蒸气蒸馏法:参照王广利的方法［8］，将陈蛀屑、新蛀屑和树皮各10 g分别置于1 000 mL的圆底烧瓶中，加入400 mL的蒸馏水蒸馏至得到200 mL蒸馏液时止，得到3种粗提液。将3种粗提液分别用120 mL的二氯甲烷萃取，每次30 mL，萃取4次，得到S1、S2、S3提取液。陈蛀屑蒸馏液再用正己烷萃取，得到提取液W1。

3种提取方法共获得11种提取液，分别加入无水硫酸钠干燥、过滤;滤液分别在40℃水浴中经旋转蒸发器浓缩至1.0 mL，备用。

1.5 GC-MS分析

弹性石英毛细管柱(25 m×200 μm×0.33 μm)。升温程序:初始温度50℃，保持1 min，8℃·min－1升至120℃保留5 min，10℃·min－1升至220℃保留10 min。气化室温度为280℃，载气为氦气，流速1 mL/min，无分流进样，进样量1 μL。电离源为EI，电子能量70 eV，离子源温度230℃，扫描范围30～500质量单位。挥发性物质经GC－MS分析后，所得质谱图谱利用计算机标准质谱图库(NIST98)并辅助以人工识别确定化合物，以质谱离子峰面积百分数表示各成分相对含量［5，8，11－13］。

1.6 触角电位反应

触角电位测定刺激气流流速、持续气流均设定为 400 mL·min－1，刺激时间0.5 s，2 次刺激间隔30 ～60 s，以保证触角的活性完全恢复为准。将剪成2.0 cm×0.5 cm的定性滤纸纸条折成“之”字形作为各溶液的载体，待系统平稳后测试。触角与气味混合管的出气管相距1 cm。以溶解各单体相应的溶剂为对照;测定青杨脊虎天牛对同种化合物、不同剂量的EAG反应时，刺激顺序按质量浓度由低到高进行。在进行EAG试验时，雌、雄成虫的触角随机使用，不区分背、腹面。各种测定同个触角连续重复3次。以相应的溶剂为对照［14－15］。

1.7 青杨脊虎天牛行为反应

参照严善春等［15］、Bertschy 等［16］的方法。将青杨脊虎天牛成虫放在“Y”型管基部，待前一头虫前行4～5 cm后放入另一头。观察成虫的行为反应。1 min内进入某一臂，定为对这一侧有趋性，进入与气味源相连接的一臂记作虫体对气味源有趋向性或正趋向性，未进入与气味源相连接的一臂记作虫体对气味源无趋向性或有负趋向性，未进入两臂的记作无反应。每种单体挥发物测试6次重复，每个重复10头虫。更换不同气味源时，彻底清洗整个装置。驱避率、诱集率及反应率的计算方法见参考文献［14－15］。

1.8 数据分析

用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行方差分析和多重比较［14，17－19］。

2 结果与分析

2.1 青杨脊虎天牛蛀屑和寄主树皮挥发物的鉴定

提取并浓缩后的 Z1、Z2、Z3、E1、E2、E3、S1、S2、S3、W1和Y1提取物，经 GC－MS分析后，用计算机标准质谱图库和人工识别后确定的化合物种类及其相对含量，见表2。直接浸提、26℃水浴浸提和水蒸气蒸馏3种方法共分离鉴定出92种挥发物。陈蛀屑、新蛀屑、寄主杨树树皮中提取的共有组分有12种即:甲苯、己醛、乙苯、对二甲苯、苯乙烯、2－丁氧基乙醇、3－丁氧基－2－丙醇、2－乙基－2－己烯－1－醇、苯甲酸乙酯、甘菊环、2，6－二叔丁基对甲基苯酚、1，2－苯二甲酸二丁酯。新蛀屑中特异性的化学组分只有甲基丙烯酸甲酯、乙二酸二甲酯2种;陈蛀屑和树皮中的特异性化学组分较多，而陈蛀屑中又以大分子的甾醇类偏多。陈蛀屑和新蛀屑有4种共有成分，即:己醛、乙苯、2－丁氧基乙醇和2－羟基苯甲醛;新蛀屑和树皮有4种共有成分，即:苯乙烯、3－丁氧基－2－丙醇、2－丁氧基乙醇和2－羟基苯甲醛。

表2 青杨脊虎天牛蛀屑和杨树皮挥发物的GC－MS分析结果 %

续(表2)

2.2 不同提取方法和萃取剂提取效果的差异

采用水蒸气蒸馏法、26℃水浴提取法和直接浸提3种方法，获得的物质种类和数量均不相同。二氯甲烷直接浸提法获得的挥发物种类较少，只有17种。水蒸气蒸馏法得到37种挥发物质。26℃水浴提取法提取挥发物数量与水蒸气蒸馏法相近，得到34种挥发物，而且26℃水浴提取法是常温提取法，提取温度与青杨脊虎天牛羽化时的自然温度接近，获得的物质可能更接近自然挥发的组分。

采用直接浸提、26℃水浴浸提和水蒸气蒸馏3种方法，乙醚、二氯甲烷和正己烷3种萃取剂对青杨脊虎天牛陈蛀屑进行萃取，发现萃取出的物质种类和数量也不同(表3)。

二氯甲烷直接浸提法(Z1)和水蒸气蒸馏后，再用二氯甲烷(S1)和正己烷(W1)萃取出的物质种类都较少，分别只有6、6、10种。26℃水浴提取法和乙醚直接提取法所提取出的化合物种类较多，数量相近，特异性化合物也较多，但乙醚提取出的大分子甾醇类、烷类相对较多(表3)。所以提取陈蛀屑中的挥发性物质用26℃水浴浸提较为理想。

表3 不同萃取剂对陈蛀屑的萃取结果

2.3 青杨脊虎天牛对陈蛀屑和树皮挥发物的EAG反应

青杨脊虎天牛对寄主植物的同一部位不会进行二次危害，因此试验选取陈蛀屑中具有的邻甲氧基苯甲醛、反式－1，2－环己二醇、N－乙基苯胺、苯并噻唑、棕榈酸和寄主树皮中提取的、存在广泛的顺－3－己烯醇及7号和8号混合物，进一步对其进行触角电位和生物活性测定(表4)。

表4 青杨脊虎天牛雌、雄虫对陈蛀屑和树皮挥发物的EAG反应

由表4可知，除8号混合物和N－乙基苯胺外，青杨脊虎天牛雌虫对其余物质的反应敏感程度都高于雄虫。雌、雄虫对N－乙基苯胺的反应值相近;对顺－3－己烯醇和邻甲氧基苯甲醛的反应趋势相同即都在0.1 g·L－1出现最大值;7、8号混合物只有1种物质不同，即:7号混合物比8号多1份N－乙基苯胺，但EAG反应趋势和反应值有明显的差别。N－乙基苯胺本身不能引起青杨脊虎天牛雌、雄成虫的明显的EAG反应，但雌虫对含有1份N－乙基苯胺的7号混合物(顺－3－己烯醇、邻甲氧基苯甲醛、N－乙基苯胺、苯并噻唑4种物质1∶1∶1∶1)发生强烈反应，是对照的8.7倍，说明N－乙基苯胺可能在引起青杨脊虎天牛雌虫EAG反应的过程中，起着重要的协同作用;青杨脊虎天牛雌虫对8号混合物各质量浓度EAG反应的敏感程度都低于雄虫，也同样可以说明N－乙基苯胺对引起青杨脊虎天牛雌虫EAG反应的重要性。

2.4 青杨脊虎天牛对寄主挥发物的行为反应

青杨脊虎天牛对不同质量浓度的8种挥发物EAG反应结果表明，青杨脊虎天牛对N－乙基苯胺和棕榈酸不同质量浓度的EAG反应值平缓而且反应值小。所以选择顺－3－己烯醇、邻甲氧基苯甲醛、反式－1，2－环己二醇、苯并噻唑及其2种混合物的较大质量浓度做“Y”形管的生测试验(表5)。行为生测结果表明，青杨脊虎天牛对这6种物质的反应率普遍低，最大反应率为80%，小于对α－蒎烯、松节油、水杨醛的反应率［13］。雌虫对 1.0 g·L－1反式－1，2－环己二醇表现出显著的驱避行为(P＜0.05)，对0.1 g·L－1苯并噻唑表现出显著的诱引反应(P＜0.05);雄虫对0.1、1.0 g/L－1的 7 号混合物均表现出显著的驱避反应行为(P＜0.05)。顺－3－己烯醇、邻甲氧基苯甲醛和8号混合物对雌、雄虫无明显的定向作用。

表5 青杨脊虎天牛雌虫、雄虫对不同质量浓度寄主挥发物的行为反应

3 结论与讨论

在很多情况下，EAG电位并不能代表昆虫的行为反应，其原因主要有2点:第一，触角去极化只能代表许多神经元对刺激物有所反应，并不能区分具体的行为作用。而气味对昆虫的行为作用是极其复杂的，除了定向作用外，还有抑制作用或增效作用。所以，EAG电位只能证明昆虫对气味是否有感知能力。第二，在昆虫触角中，少数神经元的反应也可能起重要的行为作用。EAG只是检测整个触角对化合物反应后电位的变化。因此不能仅靠昆虫EAG反应程度来判定昆虫行为反应的大小［20］。植物创伤诱导挥发物的种类很多，主要组分有绿叶性气味、萜烯类化合物、含氮化合物、含硫化合物以及其它化合物五大类，其中最常见的是萜烯类化合物和脂肪酸衍生物。目前，对天牛挥发物质的研究热点也主要集中在烯萜类化合物上。本研究则广泛选取非烯萜类化合物和混合物进行EAG和行为反应测试，邻甲氧基苯甲醛、N－乙基苯胺、反式－1，2－环己二醇、苯并噻唑、棕榈酸是树皮挥发物中没有而陈蛀屑中具有的成分。结果显示，N－乙基苯胺在引起青杨脊虎天牛雌虫EAG反应的过程中，起着重要的协同作用。所以，开展杨树树皮挥发性物质中非萜烯类化合物的单体和单体混配对青杨脊虎天牛作用的研究工作也将是未来工作的方向和发展目标。

行为生测结果表明，青杨脊虎天牛对顺－3－己烯醇、邻甲氧基苯甲醛、反式－1，2－环己二醇、苯并噻唑及2种混合物的反应率普遍较低，最大反应率为80%。而程红［14］用α－蒎烯、松节油、水杨醛的试验中，青杨脊虎天牛的反应率较高。这种情况与目前普遍使用的“Y”形管的设计和计算方法有关。青杨脊虎天牛停留在基部、入虫口处的都视为无反应。本试验中，青杨脊虎天牛向入虫口处和通风口处爬行的数量较多。这种情况是药剂的驱避作用，还是其它作用使然还有待进一步的研究。行为生测结果表明 1.0 g·L－1反式－1，2－环己二醇和 0.1 g·L－1苯并噻唑对青杨脊虎天牛雌虫的驱避和诱引反应有显著差异;对 0.1、1.0 g·L－1的 7 号混合物对雄虫的驱避和诱引反应有显著差异。青杨脊虎天牛雌、雄成虫对单体和混合物的行为反应不同，也证明有必要进一步研究混合挥发物对青杨脊虎天牛的引诱作用。

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