毫米波辐照所致急性应激对小鼠细胞因子和Th1/Th2免疫平衡的影响

孙嵘，马琼，杜丽，蔡金玲，杨晓云，高艳，崔玉芳，毛建平

·军事医学·

毫米波辐照所致急性应激对小鼠细胞因子和Th1/Th2免疫平衡的影响

孙嵘，马琼，杜丽，蔡金玲，杨晓云，高艳，崔玉芳，毛建平

目的探讨35GHz毫米波辐照诱发的小鼠急性应激细胞因子，尤其是Th1/Th2型因子的变化规律及其对免疫平衡的影响。方法BALB/c小鼠经35GHz、420mW/cm2功率密度的毫米波源急性辐照60s，红外监测仪实时监测小鼠背部皮肤温度变化。于辐照后不同时间点检测小鼠外周血象、胸腺及脾脏指数，并用ELISA法检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6及Th1/Th2型细胞因子IFN-γ、IL-4的变化。结果辐照开始后小鼠耳廓温度迅速升高到50℃，至辐照50～60s时升至约60℃。辐照后6h外周血白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)出现明显的一过性降低，至辐照后1～7d基本恢复至对照水平。胸腺指数在辐照后6h短暂升高后逐渐降低，至辐照后7d明显低于对照组。脾脏指数在辐照后3、7d均出现明显升高。外周血IL-1β在辐照后6h即迅速升高至峰值，1d降至最低(P＜0.05)，3～7d逐渐恢复至对照水平；而IL-6在辐照后6h～3d明显升高，1d升至峰值，7d仍明显高于对照组(P＜0.05)。Th1和Th2型细胞因子IFN-γ和IL-4在辐照后3d均升高至峰值，至7d仍明显高于对照组(P＜0.01)。Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值在辐照后1、3d分别增高为对照值的1.34和1.66倍(P＜0.05)。结论35GHz毫米波急性辐照小鼠能诱发明显的热效应，血清细胞因子应激性升高，Th1/Th2平衡明显向Th1免疫方向偏移，表明免疫调节在毫米波辐照诱发的急性应激反应中发挥了重要的调节作用。

毫米波；应激；细胞因子类；免疫平衡

因毫米波(millimeter-wave，MMW)具有频率高、波长短、有一定穿透力的特点，已被广泛应用于无线通信、医学、军事等领域。目前，毫米波的生物效应及相关的防护研究备受关注。已有研究发现，毫米波辐照可引起体表温度升高[1-2]，而高功率毫米波辐照对机体免疫系统影响的报道鲜见。免疫系统及其分泌的免疫因子组成了一个庞大、复杂而有序的网络系统，其稳态调控对机体适应内外环境变化、特别是维持机体内环境的稳定至关重要。Th1和Th2型辅助性T细胞及其分泌的细胞因子在机体细胞免疫和体液免疫中发挥着重要的调节作用[3]。然而，急性应激时机体所产生的糖皮质激素对Th1/Th2免疫平衡的影响，能直接诱发机体对疾病的易感性[4]。据此，本实验观察35GHz毫米波辐照诱发的小鼠急性应激反应中的重要细胞因子，尤其是Th1/Th2型因子的变化规律，并重点分析Th1/ Th2免疫平衡的变化特点，以期能为毫米波诱发的免疫损伤机制及其医学防护提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性二级BALB/c小鼠30只，体重20±2.0g，购自军事医学科学院实验动物中心，并饲养于该中心二级动物房。按照取材时间分为对照组、6h组和1、3、7d共5组，每组6只。

1.2 主要试剂 小鼠IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 辐照条件 小鼠背部剪毛后束缚四肢，采用35GHz、平均功率密度420mW/cm2的毫米波源进行辐照。辐照时间60s，对照组行假照射。辐照全程使用红外监测仪实时监测小鼠背部皮肤温度变化，并用视频监控系统实时监测其行为学变化。

1.4 外周血血象分析 分别于辐照后5h和1、3、7d取小鼠尾静脉血20μl，以全自动血细胞分析仪检测外周血象的变化。

1.5 脏器指数 分别于辐照后6h和1、3、7d将小鼠称重，取血后脱颈处死，解剖取出胸腺、脾脏称重。根据公式[脏器指数=脏器质量(g)/体重(g)×100%]计算脏器指数。

1.6 ELISA法检测血清细胞因子含量 分别于辐照后6h和1、3、7d经眼眶取血，离心收集血清，参照ELISA试剂盒说明书进行IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6及IFN-γ等细胞因子的检测。具体步骤如下：将标本及不同浓度标准品加入酶标板，37℃孵育90min；洗板后加入生物素化抗体工作液，37℃孵育60min；洗板后加入酶结合物工作液，37℃孵育30min；洗板后加入显色剂，避光孵育10～15min后加入终止液，混匀后在酶标仪上测量450nm处的吸光度(A)值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行分析。数据结果以表示，组间比较采用方差分析，进一步两两比较，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett's T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 辐照过程中小鼠体表温度和行为学变化 辐照前，小鼠无明显躁动，体表温度约为32℃(图1A)。辐照开始后10～20s，小鼠即出现躁动不安，扬颈，耳廓温度迅速升高到50℃以上(图1B)。辐照50～60s时耳廓温度升高到60℃，背部局部温度也升高至约50℃(图1C)。而辐照90s后，红外监测显示小鼠整个背部温度均超过50℃(图1D)。同时小鼠出现四肢僵硬、尾部上翘现象。所有辐照90s的小鼠存活均未超过24h。

图1 毫米波急性辐照后小鼠体表温度和行为学变化Fig.1 Changes of mouse shell temperature and ethology after acute MMW radiation

2.2 外周血象变化 小鼠外周血白细胞(WBC)在辐照后6h出现一过性降低(P＜0.05)，1d后逐渐恢复至正常水平。淋巴细胞(LYM)绝对数呈现相似的变化趋势，而RBC辐照后未观察到明显改变(表1)。

表1 毫米波急性辐照后小鼠外周血象的变化s,n=6)Tab.1 Changes of peripheral haemogram after acute MMW radiation (±s,n=6)

表1 毫米波急性辐照后小鼠外周血象的变化s,n=6)Tab.1 Changes of peripheral haemogram after acute MMW radiation (±s,n=6)

(1)P＜0.05 compared with control group

GroupRBC(×1012/L)WBC(×109/L)LYM(×109/L) Control10.00±1.347.93±1.167.87±1.18 6h9.87±1.86 4.63±0.15(1)4.53±0.15(1)1d9.86±0.167.50±0.307.40±0.30 3d9.77±1.057.83±0.957.43±0.55 7d9.30±0.897.73±0.357.63±0.35

2.3 脾脏和胸腺指数变化 辐照后3、7d小鼠脾脏指数明显高于对照组(表2)；而胸腺指数在辐照后6h即出现显著升高(P＜0.01)，随后逐渐降低，至7d时明显低于对照组(P＜0.01)。

表2 毫米波急性辐照后小鼠脏器指数的变化Tab.2 Changes of mouse organ index after acute MMW radiation

2.4 外周血IL-1β、IL-6和IL-2含量的变化 辐照后6h，IL-1β即出现显著升高(P＜0.05)，辐照后1d降至最低(P＜0.01)，3d后开始回升，至7d接近正常水平。IL-6在急性辐照后6h即明显升高，1d升至峰值(P＜0.01)，而后出现下降，然而直至7d仍明显高于对照组(P＜0.05)。IL-2水平在辐照后未见有统计学意义上的变化(图2)。

图2 毫米波急性辐照后小鼠血清IL-1β、IL-6和IL-2含量变化Fig.2 Changes of mouse serum IL-1β, IL-6 and IL-2 levels after acute MMW radiation

2.5 外周血Th1/Th2型细胞因子IFN-γ、IL-4含量的变化 IFN-γ在急性辐照后6h即出现明显升高(P＜0.05)，3d达到峰值，7d时下降但仍明显高于对照组(P＜0.01)。而IL-4在辐照后1～7d持续升高，均明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01，图3A)。

2.6 外周血Th1/Th2比值的变化 由于毫米波急性辐照后IFN-γ和IL-4各自升高的幅度不同(辐照后1、3d IFN-γ升高，分别为对照组的1.66和2.22倍，而IL-4仅为对照组的1.24和1.35倍)，导致Th1/ Th2(IFN-γ/IL-4)比值的显著增高，辐照后1、3d该比值分别为对照值的1.34和1.66倍(P＜0.05)，即发生了明显的Th1/Th2模式向Th1免疫反应偏移的现象(图3B)，至辐照后7d恢复至正常水平。

3 讨 论

图3 毫米波急性辐照后小鼠外周血IL-4、IFN-γ含量(A)及Th1/Th2比值(B)的变化Fig.3 Changes of mouse serum IL-4, IFN-γ content (A) and Th1/Th2 ratio (B) after acute MMW radiation

毫米波频率高，趋肤深度较小，可在皮肤局部产生明显的热效应[5]。本实验中观察到35GHz毫米波辐照短时间内小鼠耳廓温度迅速升高到50℃，至辐照50～60s时约升高至60℃，显示急性毫米波辐照引起了明显的热效应。这种热效应不仅能引起局部的皮肤损伤，辐照时间达90s时可导致小鼠在24h内死亡，这一结果与王立斌等[6]及徐志伟等[7]的研究结果相同，这可能与毫米波急性辐照后动物体温急剧升高、生理状态及免疫功能急剧变化有关。据此在本实验中采用35GHz毫米波辐照60s后观察小鼠外周血象及细胞因子的变化规律，重点分析Th1/ Th2免疫平衡在急性辐照后的变化。

本实验观察到辐照后6h，小鼠外周血WBC、LYM出现一过性降低，可能是机体对毫米波急性辐照的全身性应激反应的结果。同时还观察到胸腺指数早期(6h)即升高而后期(3～7d)则降低，而脾脏指数在辐照后3～7d时才出现明显升高，表明毫米波辐照后，不同免疫器官显示出不同的应激反应，作为中枢免疫器官的胸腺对急性毫米波辐照显示出较高的敏感性，而脾脏作为外周免疫器官其脏器指数的增加，可能是应激诱导的代偿性增殖，抑或是在本实验辐照条件下毫米波可能对免疫系统具有双向免疫调节作用。

已知在热应激过程中能产生多种细胞因子，而且与神经内分泌系统的应激调节密切相关[8]。本实验结果显示，毫米波急性辐照所致的热应激不仅可引起IL-1β、IL-6等细胞因子出现规律性改变，而且能使机体的免疫平衡发生改变。有文献报道，IL-1β、IL-2和IL-6不仅具有多种免疫调节效应，而且还可以作用于下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的不同位点，产生神经内分泌效应[9]。而Th1/Th2免疫平衡调节在神经内分泌和免疫系统的交互通讯中起着重要作用[10]。本实验结果显示，IL-1b、IL-6、IFN-γ和IL-4在毫米波急性辐照后0.25d即迅速升高，表明一方面小鼠细胞因子应激性合成分泌增加，另一方面这种增加可能与机体早期的炎症反应有关。随后(1d)IL-1β浓度虽明显降低，但与机体炎症反应相关的IL-6、IFN-γ和IL-4浓度仍明显高于对照水平。然而，由于IFN-γ和IL-4升高的幅度不同，导致辐照后Th1/Th2比值出现显著增高，即发生了Th1/Th2免疫平衡模式向Th1免疫反应明显偏移的现象。以上结果表明，毫米波辐照急性应激不仅引起小鼠体内重要细胞因子发生改变，而且能使Th1/Th2免疫平衡系统发生明显改变，导致机体防御功能紊乱。而毫米波辐照后7d，Th1/Th2免疫平衡的恢复可能与机体神经-内分泌-免疫网络间的相互调节作用有关，这一推论尚需进一步的实验证实。

综上所述，小鼠经420mW/cm2毫米波急性辐照可引起明显的热效应，IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-4等细胞因子应激性升高，Th1/Th2免疫平衡改变，该结果为毫米波免疫损伤的机制及靶向研究提供了重要依据。

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Changes of mouse cytokines and Th1/Th2 balance in acute stress induced by millimeter-wave

SUN Rong, MA Qiong, DU Li*, CAI Jin-ling, YANG Xiao-yun, GAO Yan, CUI Yu-fang, MAO Jian-ping
Institute of Radiation and Irradiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
*

, E-mail: lily5847@163.com
This work was supported by Open Issues of State key Laboratory of Millimeter Waves (K200909, K201225)

ObjectiveTo explore the regular pattern of variation of cytokines, especially the Th1/Th2 cytokines, and its effect on immune balance in stress induced by 35GHz millimeter-wave (MMW) exposure in mice.MethodsBALB/c mice were exposed to 420mW/cm2, 35GHz MMW for 60s, and the dorsal skin temperature was real-time monitored with infrared monitor during the period of exposure. Peripheral WBC, thymic and splenic indexes of mice were detected at different time points after MMW exposure. Meanwhile, the contents of serum IL-1β, IL-2, IL-6 and Th1/Th2 cytokines IFN-γ, IL-4 were analyzed by ELISA.ResultsThe temperature of ear auricle rapidly increased to 50℃ after initiation of exposure, and continuously rose to about 60℃at 50s to 60s. Peripheral WBC and lymphocytes showed transient reduction at 6h and restored to the control level from 1 to 7d after radiation exposure. Compared with control group, thymus index displayed a transient increase at 6h and thereafter decreased, and then diminished to which significantly lower than control level 7d after radiation exposure. However, spleen index increased significantly on day 3 and day 7 after radiation exposure. Peripheral IL-1β levels immediately increased to the maximum at 6h and decreased to the minimum at 1d (P＜0.05), then gradually recovered to control level during 3d and 7d after radiation exposure. However, IL-6 level displayed a significant increment from 6h to 3d, and increased to peak value at 1d and still obviously higher than that of control group up to 7d (P＜0.05) after radiation exposure. Simultaneously, Th1/Th2 cytokines IFN-γ and IL-4 both increased to the maximal at 3d and still significantly higher than those of control group at 7d (P＜0.01) after radiation exposure. Ratios of Th1/Th2 (IFN-γ/IL-4) evidently raised to 1.34 and 1.66 times of control values at 1d and 3d respectively (P＜0.05).Conclusions35GHz MMW exposure can induce obvious thermal effects in mice, and serum cytokines increase due to stress, the Th1/Th2balance drifts significantly to Th1 immune response, thus indicating that immune-regulation may play an important regulatory role in acute stress induced by MMW exposure.

millimeter-wave; stress; cytokines; immune balance

Q684

A

0577-7402(2013)10-0859-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.017

2013-06-27；

2013-08-10)

(责任编辑：李恩江)

毫米波国家重点实验室开放课题(K200909，K201225)

孙嵘，医学博士，助理研究员。主要从事辐射免疫损伤机制及防护方面的研究

100850 北京 军事医学科学院放射与辐射医学研究所(孙嵘、马琼、杜丽、蔡金玲、杨晓云、高艳、崔玉芳、毛建平)

杜丽，E-mail：lily5847@163.com