大豆转基因检测中DNA提取方法的比较研究

刘 欣，祝长青,，王毅谦，沈 赟，黄 明,*，蒋 原，周光宏

(1.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095；2.江苏出入境检验检疫局，江苏 南京 210001；3.江苏疾病预防控制中心，江苏 南京 210009)

大豆是我国乃至全世界重要的经济与粮食作物，是食用油和植物蛋白最丰富、最廉价的来源。为了提高大豆的产量，满足人们对大豆的需求量，科研人员采用基因工程与分子辅助育种方法，培育了一些高产、优质和抗逆以及适合农场机械化种植的转基因大豆品种。2010年国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)的数据显示：2010年转基因大豆仍然是最主要的转基因作物，种植面积约7330万公顷，占全球转基因作物种植面积的50%左右。中国从上世纪末开始进口耐除草剂转基因大豆，各种与转基因大豆相关的产品越来越多地进入市场[1]。目前，对于转基因食品的安全性存在很多争议，各国先后制定了有关转基因食品检测、标识以及管理的各项措施[2-3]。为保障广大消费者的知情权和选择权，满足国际贸易的需要，建立准确、快速、高效的转基因成分检测技术至关重要。核酸检测技术，尤其是常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和实时荧光PCR法，已经被广泛应用于食品生物安全检验等多个领域[4-5]，成为目前成熟的主流基因检测平台。核酸检测的关键因素是提取到高质量的DNA[6]。不同植物材料的DNA提取方法各异，但是总体思路都是先用去污剂将细胞膜及核膜破裂，然后用化学药剂将蛋白质及多糖沉淀去除，最后沉淀纯化DNA[7]。大豆材料中因含有较多的蛋白和脂类，其DNA提取的难度较大[6]。提取大豆DNA常使用SDS法提取大豆幼嫩叶片的DNA，获得的大豆DNA质量较高，但是需要耗费大量的时间与精力将大豆培养至幼苗期[8]，难以应用于实际转基因大豆的检测。转基因大豆检测与进出口大豆检测常从大豆子粒中提取DNA，这样可以节省植物幼苗的培育时间。国内外学者、生物公司也在大豆子粒DNA提取上进行研究，开发了一些基于SDS和CTAB的大豆子粒DNA提取方法[9-10]以及相关试剂盒。

本研究以大豆子粒为材料，比较Bayer、DuPont、Monsanto公司提供的3种大豆DNA提取方法以及国际上使用较多的商品化Qiagen试剂盒法、国内广泛使用的Tiangen试剂盒法，通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法、实时荧光PCR法分析5种方法提取的大豆DNA质量，优选出合适的大豆DNA提取方法，以实现对转基因大豆进行快速、准确检测，满足我国国内以及进出口农产品与食品中转基因检测与标识的法规需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆子粒由江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心提供，用Vorwerk搅拌器研磨成细粉，用于DNA提取。

植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：69106) 德国Qiagen公司；植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP320-02) 北京Tiangen公司；λ DNA/Hind Ⅲ Marker、Proteinase K、RNase A 日本Takara公司；琼脂糖 基因科技(上海)有限公司；荧光PCR扩增试剂LightCycler 480 Probes Master预混液 瑞士Roche公司；大豆凝集素基因(lectin)引物 上海辉睿生物技术有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

搅拌器 德国Vorwerk公司；杂交炉 德国GFL公司；J-E冷冻离心机 美国Beckman公司；Centrifuge 5417C微型离心机 德国Eppendorf公司；MB-102恒温振荡金属浴 日本Bioer公司；C130-1230V 手掌离心机 美国Labnet公司；NanoDrop 1000 微量紫外-分光光度计 美国Thermo公司；AQE-183-2 全自动凝胶成像系统 英国Syngene公司；LightCycler 480Ⅱ实时荧光PCR扩增仪 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取方法

1.3.1.1 Bayer公司的方法[11]

取2g大豆粉末放入50mL离心管中，加入10mL提取缓冲液，加入0.7mL 20% SDS，混匀后60℃温育30min，期间不断晃动。待材料冷却至室温后8000×g离心5min，吸取1mL上清液至新的离心管中，按比例调整各试剂用量，用氯仿代替苯酚，进行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE缓冲液溶解DNA。

1.3.1.2 DuPont公司的方法[12]

取2g大豆粉末放入50mL离心管中，加入10mL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)裂解缓冲液和20μL Proteinase K (20mg/mL)，混匀后60℃温育2h，期间不断晃动。待材料冷却至室温后8000×g离心5min，吸取1mL上清液至新的离心管中，用氯仿代替苯酚，进行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE缓冲液溶解DNA。

1.3.1.3 Monsanto公司的方法[13]

取2g大豆粉末放入50mL离心管中，加入10mL溶液，包括9.8mL事先加热的CTAB裂解缓冲液、0.2mL β-巯基乙醇和50μL Proteinase K(20mg/mL)，混匀后60℃温育1h，期间不断振摇。待材料冷却至室温后8000×g离心5min，吸取1mL上清液至新的离心管中，按比例调整各试剂用量，用氯仿代替苯酚，进行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE缓冲液溶解DNA。

1.3.1.4 Qiagen试剂盒提取方法

取2g大豆粉末放入50mL离心管中，加入10mL AP1溶液和30μL Proteinase K(20mg/mL)，混匀后60℃温育1h，期间不断晃动。待材料冷却至室温后8000×g离心5min，吸取500μL上清液至新的离心管中，根据试剂盒说明进行DNA提取，最后用100μL AE缓冲液洗脱。

1.3.1.5 Tiangen试剂盒提取方法

取2g大豆粉末放入50mL离心管中，加入6mL LP1溶液和50μL Proteinase K(20mg/mL)，混匀后60℃温育30min，期间不断晃动。待材料冷却至室温后8000×g离心5min，吸取400μL上清液至新的离心管中，根据试剂盒说明进行DNA提取，最后用100μL TE缓冲液洗脱。

1.3.2 DNA纯度、得率的检测

用NanoDrop1000微量紫外-分光光度计测定样品液的纯度及质量浓度。DNA的纯度取决于A260/A280、A260/A230的大小；DNA质量浓度由DNA模板在260nm波长处的吸光度决定，A260=1时DNA质量浓度为50ng/μL[14]。DNA得率用q测验进行多重比较，DNA得率根据下式计算：

1.3.3 DNA分子质量和完整性的检测

用1×TAE溶液配制1%的琼脂糖凝胶，EB染料加入琼脂糖凝胶中。取10μL DNA溶液与2μL 6×Loading Buffer混合后点样。然后在80V恒定电压条件下进行电泳，电泳时间60min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶块置于凝胶成像系统中，观察、拍摄电泳图谱并进行分析。

1.3.4 DNA用于实时荧光PCR扩增的适应性检测

取DNA溶液以及相应的10倍稀释液作为模板，对大豆内源基因lectin进行实时荧光PCR扩增，并设置空白对照。根据国家标准GB/T 19495.5—2004《转基因产品检测：核酸定量PCR方法》合成lectin基因特异性的引物和探针见表1。优化的反应体系见表2，DNA样品的10倍稀释液与原液加入相同的体积进行实时荧光PCR反应。优化后反应条件为：预变性95℃反应10min，1个循环体系为95℃反应15s，59℃反应1min同时收集荧光，共进行55个循环。

表 1 设计的引物、探针Table 1 Primers and probe of real-time fluorescent PCR amplification of lectin

表 2 lectin基因的TaqMan实时荧光PCR反应体系Table 2 Reaction system of real-time fluorescent PCR amplification of lectin

2 结果与分析

2.1 5种提取方法的DNA纯度与得率

表 3 5种方法提取大豆DNA纯度、得率比较Table 3 Purity and yield of DNA from soybean with five methods

上述5种提取方法均能从大豆中提取出DNA，但由表3可知，提取效果有明显差异。由每种方法重复2次所得数据的平均值，对大豆子粒而言，采用Bayer法、Monsanto法提取DNA的A260/A280、A260/A230均较小，表明存在蛋白质、多糖、盐等杂质，所提取的DNA纯度不高；采用DuPont法提取的DNA的A260/A280接近1.7，A260/A230＜2.0，表明所提取的DNA去除蛋白质效果较好但是仍有蛋白质残留，并且存在多糖、盐等杂质；Tiangen试剂盒法提取DNA的A260/A280在1.7～1.9之间，A260/A230＜2.0，表明所提取的DNA中残存多糖、盐和小分子杂质等；采用Qiagen试剂盒法提取的DNA的A260/A280＞1.9，A260/A230＞2.0，表明DNA样品中有RNA。就DNA得率而言，Bayer法的DNA得率显著高于其他4种方法(P＜0.05)，Qiagen试剂盒法的DNA得率显著高于Tiangen试剂盒法、DuPont法与Monsanto法(P＜0.05)，Tiangen试剂盒法与DuPont法的DNA得率差异不显著(P＞0.05)，Monsanto法的DNA得率最低，且与其他方法差异显著(P＜0.05)。综合考虑DNA纯度与得率，Qiagen试剂盒法、Tiangen试剂盒法与DuPont法效果较好，Monsanto法与Bayer法效果较差。

2.2 5种提取方法的DNA完整性

图 1 5种方法提取的DNA凝胶电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of DNA with five methods

DNA样品琼脂糖凝胶电泳图谱见图1。Bayer法、DuPont法、Qiagen试剂盒法、Tiangen试剂盒法均可提取出DNA，其片段大于23kb，RNA降解较为完全，提取得到的DNA完整性较好。从图1还可以看出，虽然电泳上样量相同，但DNA条带亮度有较大区别：Bayer法提取的DNA样品，通过260nm时的吸光度计算，判断其得率最高，但在电泳时发现其DNA条带亮度较低、点样孔较亮且主带下方有拖带现象，说明在样品中存在蛋白质、多糖等杂质的污染；DuPont法、Qiagen试剂盒法、Tiangen试剂盒法提取的DNA条带明亮；Monsanto法提取出DNA经电泳未观察到明显的条带。因此，DuPont法、Qiagen试剂盒法、Tiangen试剂盒法提取的DNA纯度高、产率高、完整性好。

2.3 大豆lectin基因的实时荧光PCR扩增

以5种方法提取的DNA样液与其10倍稀释液取等体积液体作为DNA扩增模板，对大豆内源基因lectin进行实时荧光PCR扩增，结果见图2。

图 2 DNA与其10倍稀释液的lectin基因的扩增结果Fig.2 Fluorescent PCR amplification of lectin using DNA and 10-fold dilution as template

由图2可知，除了以Monsanto法提取的DNA为模板的扩增没有特征图谱外，Bayer法、DuPont法、Qiagen试剂盒法与Tiangen试剂盒法提取的DNA与其10倍稀释液为模板扩增均得到典型的扩增对数图谱，说明使用Monsanto法提取大豆的DNA不适合进行实时荧光PCR。

对数图谱反映的是荧光量的对数与PCR循环次数的关系，指数扩增阶段PCR产物随循环数指数增长且扩增效率稳定，荧光量等比例增长[15]，因此指数扩增阶段荧光量的对数随循环数呈线性增加，其斜率与扩增效率正相关。由图2A可见，Bayer法提取的DNA在指数扩增阶段时荧光量对数的增长明显较10倍稀释液的平缓，说明Bayer法提取得到的DNA进行实时荧光PCR的扩增效率较10倍稀释液的低，故使用Bayer法提取得到的DNA中存在杂质，抑制实时荧光PCR的扩增；由图2B、2D与2E可见，DuPont法、Qiagen试剂盒法和Tiangen试剂盒法提取的DNA与其10倍稀释液的扩增曲线的指数增长期的平行性良好，说明使用DuPont法、Qiagen试剂盒法、Tiangen试剂盒方法提取得到的DNA无明显抑制实时荧光PCR扩增的杂质存在。

3 讨论与结论

本实验以大豆子粒为材料，研究Bayer、DuPont、Monsanto公司提供的3种大豆DNA提取方法以及国外的Qiagen试剂盒法、国内的Tiangen试剂盒法提取DNA的效果，旨在优选出简便、快速、有效的大豆DNA 提取方法。根据检测工作的实际需要，各方法使用2g大豆粉作为DNA提取样品，以保证抽取样品具有较好的代表性。由于大豆粉样品用量的增加，Qiagen和Tiangen试剂盒法增加蛋白酶用于去除过多的蛋白以减少干扰。此外，Bayer法、DuPont法、Monsanto法使用氯仿代替苯酚进行抽提去除杂质，避免苯酚残留使DNA降解以及对后续PCR所造成的抑制[16]。

Bayer法使用SDS使染色体离析、蛋白质变性，并与蛋白质和多糖结合成复合物沉淀，释放出DNA，DNA得率最高，但是DNA纯度最差，表明用SDS提取DNA时会吸附较多杂质，这与张伟等[17]的研究结果类似。DuPont和Monsanto法均使用CTAB阳离子去污剂使蛋白质变性，并与蛋白质和多糖形成复合物，释放DNA，琼脂糖凝胶电泳图谱显示DNA较完整，但是两种方法在DNA纯度与得率上存在较大差异：DuPont法通过氯仿抽提、盐溶液的浓度变化去除杂质，能提取到较高质量的DNA，与Mafra等[18]的研究结果相似；Monsanto法与王振东等[19]的方法相比，氯仿抽提次数少、多次使用醇类沉淀DNA，造成提取到的DNA杂质含量多且损失过多，因此纯度差且得率最低，不过此方法可取之处是裂解缓冲液中加入抗氧化剂β-巯基乙醇，能防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除[16]。Qiagen试剂盒法使用杂质去除离心柱与核酸吸附离心柱来提取纯化DNA，Tiangen试剂盒法使用核酸吸附离心柱提取DNA，两种方法均能提取到较高质量的DNA。因此DuPont法、Qiagen试剂盒法与Tiangen试剂盒法能够提取到纯度好、得率高、完整性较好的DNA。

核酸检测技术中实时荧光PCR技术具有敏感性高、特异性强的优点，已经成为应用范围最广泛并且成熟的转基因检测平台[20]。试验中取DNA溶液以及相应的10倍稀释液作为模板，对大豆内源基因lectin进行实时荧光PCR扩增，检验DNA对实时荧光PCR的适应性。结果表明：Monsanto法提取的DNA得率过低不能得到很好的扩增；Bayer法、DuPont法、Qiagen试剂盒法与Tiangen试剂盒法提取的DNA均能扩增出目的片段，但是Bayer法提取的DNA含有较多的实时荧光PCR抑制剂，如多糖、酚类等，影响实时荧光PCR结果准确性。因此，DuPont法、Qiagen试剂盒法与Tiangen试剂盒法提取的DNA能够用于实时荧光PCR检测。

转基因大豆的实际检测工作中，要求DNA提取方法经济、简单、快捷。Bayer法耗时至少8h，DuPont法需要5h左右，Monsanto法需要7h左右，DuPont法用时短、步骤简便，比起另外两种方法更适合在实际检测工作中应用。试剂盒法均用时短，1～2h内便可完成DNA提取工作，但是需要一定的成本支出，Qiagen试剂盒平均提取一个样品DNA花费40元，成本过高，不适合在我国大范围推广；Tiangen试剂盒平均提取一个样品DNA花费10元，具有较高的性价比，适用于实际检测工作。

综上所述，5种方法中DuPont法和Tiangen试剂盒法所提取的DNA纯度好、得率高、完整性较好，含有较少抑制因子，几乎对实时荧光PCR的检测无影响，且操作简便、性价比较高，适用于大豆DNA提取。其中Tiangen试剂盒法用时较短，但成本稍高。在实际检测工作中，应根据检测任务的紧急情况和成本，有针对性地选择合适的大豆DNA提取方法。

[1] 王澎, 金丽晨, 耿志明, 等. 食用大豆油中DNA快速提取和转基因成分定性检测[J]. 江苏农业学报, 2008, 24(6)： 940-943.

[2] ATHERTON K T. Safety assessment of genetically modified crops[J]. Toxicology, 2002, 181-182： 421-426.

[3] 张磊, 戴瓯和. 转基因大豆安全性评价与发展趋势[J]. 安徽农学通报, 2003, 9(1)： 54-55.

[4] 董薇, 曹际娟, 郑秋月, 等. 基于实时荧光PCR技术的食品中致敏原的检测[J]. 沈阳农业大学学报, 2009, 40(2)： 221-223.

[5] LOPPARELLI R M, CARDAZZO B, BALZAN S, et a1. Real-time TaqMan polymerase chain reaction detection and quantification of cow DNA in pure water buffalo mozzarella cheese： method validation and its application on commercial samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(9)： 3429-3434.

[6] 詹少华, 尹艺林. 大豆基因组DNA提取纯化方法研究[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(23)： 9871-9872; 9928.

[7] 张继红, 陶能国, 张小云, 等. 三种豆科植物总DNA提取方法的比较[J]. 湖南农业科学, 2007(2)： 31-33.

[8] 陈庆山, 刘春燕, 吕东, 等. 大豆DNA提取基本原理的探讨[J]. 东北农业大学学报, 2004, 35(2)： 129-134.

[9] 杨少辉, 张丽娟, 段会军, 等. 大豆种子DNA的提取方法[J]. 大豆科学, 2003, 22(2)： 151-153.

[10] KAMIYA M, KIGUCHI T. Rapid DNA extraction method from soybean seeds[J]. Breeding Science, 2003, 53(3)： 277-279.

[11] GRAZIOLI E, MOENS W, QUERCI M, et al. Soybean seeds sampling and DNA extraction： report on the validation of a DNA extraction methods from soybean seeds[R]. Ispra： EU-JRC, 2007.

[12] GRAZIOLI E, BONFINI L, PINSKI G, et al. Report on the validation of a DNA extraction methods from soybean seeds[R]. Ispra： EU-JRC, 2009.

[13] SAVINI C, MOENS W, QUERCI M, et al. Report on the validation of a DNA extraction methods from soybean seeds[R]. Ispra： EU-JRC, 2008.

[14] CHAPELA M J, SOTELO C G, PEREZ-MARTIN R I, et al. Comparison of DNA extraction methods from muscle of canned tuna for species identification[J]. Food Control, 2007, 18(10)： 1211-1215.

[15] 陈旭, 齐凤坤, 康立功, 等. 实时荧光定量PCR技术研究进展及应用[J]. 东北农业大学学报, 2010, 41(8)： 148-155.

[16] 王景雪, 孙毅, 高武军. 一种简便实用的植物总DNA提取方法[J]. 山西大学学报, 2000, 20(3)： 271-272.

[17] 张伟, 谢甫绨, 曹萍, 等. 大豆叶片DNA提取方法的比较研究[J]. 大豆科学, 2007, 26(1)： 60-65.

[18] MAFRA I, SILVA S A, MOREIRA E J, et al. Comparative study of DNA extraction methods for soybean derived food products[J]. Food Control, 2008, 19(12)： 1183-1190.

[19] 王振东, 孙仓, 王惠. 不同方法从大豆不同组织中提取基因组DNA效果比较[J]. 大豆科学, 2008, 27(1)： 42-46.

[20] 蒋亦武, 黄明, 王保战, 等. 转基因大豆及制品中转基因检测成分检测技术研究进展[J]. 江苏农业科学, 2011(1)： 345-348.