热处理对牛乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性影响

刘 猛，杜 明*，孔莹莹，徐伟丽，宋 微，张兰威

(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150090)

乳铁蛋白(Lf)又称乳铁传递蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，如乳汁、泪液或唾液等[1]。Lf可以作为一种铁强化剂调控铁的生物利用率，此外，Lf还具有多种其他生物功能，例如抗菌、抗病毒和抗氧化作用，参与机体免疫调节，增强机体抗病能力[2]等。近期，乳铁蛋白被发现具有促骨生长的功效[3-4]。诸多研究表明，Lf既能刺激成骨细胞(osteoblast，OB)增殖，促进成骨细胞增殖与分化、也能抑制破骨细胞生长与活性、诱导破骨细胞(osteoclast，OC)凋亡[5-6]。体内研究表明，乳铁蛋白在骨生长和代谢中起到一定的生理作用，能促进骨骼生长[7]。在乳品加工业中，热处理是最为常见的操作单元，然而迄今为止，热处理对乳铁蛋白活性的影响研究主要集中在抗菌活性等方面。热处理对乳铁蛋白成骨作用的影响报道很少，本实验主要研究热处理(温度和时间)对乳铁蛋白成骨活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

SD大鼠乳鼠(72h以内)由哈尔滨医科大学第二附属医院提供。

乳铁蛋白(＞94%)、Ⅱ型胶原酶、MTT 美国Sigma公司；α-MEM培养基、胎牛血清 美国Hyclone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液 Solarbio公司；二甲基亚砜(DMSO)、巴比妥钠 美国Gibco公司。

倒置式生物显微镜 日本Nikon公司；Eon型酶标仪 美国BioTek公司；HEPA class 100型细胞培养箱 美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞分离鉴定

从新生SD大鼠乳鼠中提取成骨细胞，通过形态观察、HE 染色、碱性磷酸酶染色及矿化结节染色来鉴定成骨细胞[8]。

1.2.2 实验分组及热处理

样品分组：Lf低质量浓度组(50μg/mL)、中质量浓度组(100μg/mL)、高质量浓度组(500μg/mL)。热处理条件：62～65℃处理 30min、72℃处理 10s、85℃处理10min以及95℃处理10min。以未经加热的乳铁蛋白(Native-Lf)为对照。

1.2.3 MTT法测定成骨细胞增殖

调节细胞质量浓度为每孔l×105个/mL接种于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液。细胞贴壁后，弃培养液，每孔再加入95μL培养液以及5μL样品溶液。测定前4h，加10μL 0.5mg/mL MTT(pH7.2 0.01mol/L PBS配制)，培养箱中孵育4h。弃去培养液，每孔加150μL DMSO，振荡10min使结晶溶解。波长490nm 处测定OD490nm[9]。

1.2.4 统计学分析及绘图

数据采用 Origin8.0软件进行计算绘图。采用SPSS 17.0统计软件，One-way ANOVA进行显著性检验。数据以±s表示，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 成骨细胞的鉴定

图 1 SD大鼠乳鼠成骨细胞分离与鉴定Fig.1 Isolation and identifi cation of osteoblasts from newborn SD rats

倒置显微镜观察成骨细胞，以不规则形、长梭形、三角形为主，相邻细胞彼此贴靠，边界难以分清，结果如图1a所示，HE染色、碱性磷酸酶染色、矿化结节染色分别如图1b～d所示，这些染色结果均表明分离的细胞具有成骨细胞的所有特征[8]。

2.2 Native-Lf对成骨细胞增殖的影响

图 2 未经过热处理的Lf对成骨细胞增殖的促进作用Fig.2 Osteoblast-promoting activity of lactoferrin without heat treatment

Native-Lf对成骨细胞增殖作用影响如图2所示，Native-Lf低质量浓度组(50μg/mL)在24、48、72h对成骨细胞增殖具有显著的促进作用；中质量浓度组(100μg/mL)作用细胞24h能显著性促进成骨细胞增殖，48h和72h能极显著促进细胞增殖；高质量浓度组(500μg/mL)在24h和48h能极显著促进细胞增殖，在72h时显著促进成骨细胞增殖。在一定质量浓度范围内，Native-Lf对成骨细胞增殖作用呈剂量依赖关系，这与文献[5,10]报道具有一致性。但24～72h不同时间点表现出的趋势略有不同，24h条件下，高质量浓度 Native-Lf活性最高，与中质量浓度和低质量浓度组差异显著；48h中质量浓度和高质量浓度组Native-Lf活性显著高于低质量浓度组；72h条件下，中质量浓度的活性显著高于低质量浓度组和高质量浓度组。整体上看，随着作用时间的延长，Native-Lf的最佳作用质量浓度有一定的下降趋势。

2.3 不同温度热处理对乳铁蛋白成骨细胞增殖的影响

2.3.1 65℃加热处理Lf对成骨细胞增殖作用影响

Lf经过65℃加热处理30min，对成骨细胞作用结果如图3所示。24h，质量浓度在50～500μg/mL时能显著促进成骨细胞增殖；48h和72h，低质量浓度组可显著促进成骨细胞增殖，在Lf为100μg/mL时能极显著促进成骨细胞增殖。高质量浓度组在48h和72h相对于对照组，有少量增加，但差异不显著。这些结果说明65℃/30min对Lf的活性影响在50～100μg/mL范围内几乎无显著影响，对于高质量浓度组有一定的影响。研究表明，这4种加热参数对于乳铁蛋白热聚集的诱导作用是不同的，随着加热强度的提高，乳铁蛋白的热聚集作用增强。高质量浓度时，Lf热聚集的趋势相应增强，相应地Lf的生理活性受影响也较为明显。

图 3 65℃/30min处理的Lf对成骨细胞增殖的影响Fig.3 Effect of 65 ℃/30 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.2 72℃加热处理Lf对成骨细胞增殖作用影响

图 4 72 ℃/10s处理LF对成骨细胞增殖的影响Fig.4 Effect of 72 ℃/10 s on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf经72℃加热处理10s，对成骨细胞增殖作用结果如图4所示。在各个时间点条件下，各质量浓度组均可显著促进成骨细胞增殖，而且低质量浓度组(50μg/mL)显著高于中质量浓度组(100μg/mL)和高质量浓度组(500μg/mL)。整体趋势与未经加热处理的Lf相差不大，这说明72℃/10s对Lf的活性影响相对较小，尤其对于质量浓度较低的情况影响较小。

2.3.3 85℃加热处理Lf对成骨细胞增殖作用影响

Lf经85℃加热处理10min，对成骨细胞增殖作用如图 5所示。24h时，低质量浓度组可极显著促进细胞增殖，中质量浓度组与对照组差异显著，高质量浓度组则极显著抑制细胞增殖；48h时，Lf在中低质量浓度时与对照组差异不显著，在高质量浓度时则极显著抑制成骨细胞增殖；72h，低质量浓度组可极显著促进细胞增殖，中质量浓度组时与对照组相比无显著差异，高质量浓度组则显著性抑制成骨细胞增殖。这些结果表明，85℃/10min对Lf活性影响较大，整体上呈下降趋势，在高质量浓度组影响较大。而且在不同时间点，活性表现不同，分析可能是由于Lf对调控成骨细胞增殖的信号通路调控作用不同造成的[11-12]。

成骨细胞的生长分化主要由以丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)细胞信号转导通路介导。主要包括ERK、JNK 和p38MAPK 3个亚通路。有研究报导了Lf调控成骨细胞p42/44MAPK等信号转导通路促进成骨细胞分化增殖，并明显地抑制成骨细胞凋亡[12]。因此，有本研究结果推测，Lf对这些信号通路的调控可能发生在不同的阶段，由此造成了上述现象。

图 5 85℃/10min处理Lf对成骨细胞增殖的影响Fig.5 Effect of 85 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.4 95℃加热处理Lf对成骨细胞增殖作用影响

图 6 95℃/10min处理Lf对成骨细胞增殖的影响Fig.6 Effect of 95 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf经95℃加热处理10min，对成骨细胞增殖作用如图6所示。24h时，低、中质量浓度组的Lf可显著性促进成骨细胞增殖，高质量浓度组(500μg/mL)则极显著性抑制成骨细胞增殖；48h与72h时，中低质量浓度组与对照组无显著差异，高质量浓度组显著性抑制成骨细胞增殖；这说明95℃加热处理10min对乳铁蛋白的活性具有明显影响，趋势与85℃/10min处理组相似。

Rüegg等[13]研究发现在pH值为6.6时，Lf在65～69℃时开始失活。研究发现Lf的Tm随pH值减小而降低，当体系pH值由7.0降至3.0时，牛乳乳铁蛋白(bLf)的Tm由70℃变化为39℃，且bLf的变性是不可逆的。程金波等[14]研究发现不同的温度与时间的热处理方式组合可以显著的影响乳中Lf的活性。有研究表明，巴氏杀菌对bLf结构及抗菌活性基本上没影响[15]。另外，蛋白质的结构决定其功能。Lf发挥功能过程中可能以骨桥蛋白(OPN)作为运转载体[16-17]，并主要通过LRP1/2介导的细胞内吞作用进入成骨细胞[18]，这些蛋白间的相互作用也随着Lf结构的变化而变化。本小组此前的研究报道了Native-Lf的变性温度为73.1℃，当处理温度大于73.1℃时，Lf发生结构变化，与OPN和LRP1等的相互作用也将发生改变，活性也将受到影响。因此本研究中65℃/30min和72℃/10s对Lf活性影响较小，85℃/10min和95℃/10min对Lf活性的影响较大，这些热处理对Lf促成骨活性的影响程度从小到大的顺序为72℃/10s＜65℃/30min＜85℃/10min＜ 95℃/10min。

3 结 论

未经加热处理的乳铁蛋白具有良好的促进成骨细胞增殖活性，在50～500μg/mL可促进成骨细胞增殖，并呈现剂量依赖关系。一定强度的热处理将破坏乳铁蛋白的促成骨活性，随着热处理强度的提高，该活性损失程度逐渐增加。65℃/30min和72℃ 10s对Lf的活性无显著影响，85℃/10min和95℃/10min对Lf成骨活性影响显著，尤其是对高质量浓度的剂量组。不同时间点，Lf对成骨细胞增殖活性的影响表现不同。

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