阪崎肠杆菌食品分离株的耐受性研究

姜琛璐，舒 畅，李 林

( 西南大学食品科学学院，重庆400715)

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，作为一种条件致病菌，它能够引起严重的新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，并能遗留严重的神经系统后遗症，死亡率高达50%［1］。阪崎肠杆菌已被国际食品微生物标准委员会(International Commission for Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)列入“对特定人群产生严重的生命危害、或产生慢性后遗症”的微生物，与肉毒梭菌(Clostridium botalinum)的A、B 型毒素、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)等具有同等的危害［2］。虽然该菌在食品中的检出率并不高，但其对婴幼儿的严重危害已逐渐引起了国际关注。重庆市2010～2012年婴幼儿食品中阪崎肠杆菌检出率分别为0.00%、0.67%和3.33%，呈现明显递增趋势。与其他食源性致病菌相比，阪崎肠杆菌的相关研究较少，这可能与其新兴性有关。Nazarowec-White 等最早在1997 年研究了阪崎肠杆菌的温度耐受性，郑晶［3］等则研究了该菌在60℃和72℃(即巴氏杀菌温度)下温度耐受性，袁飞等则综合研究了阪崎肠杆菌对温度和强酸强碱的耐受性［4］。但之前的研究多集中于分析阪崎肠杆菌在杀菌温度下的耐受性，而忽略了其在奶粉冲调温度下的存活率，且对酸碱耐受性的考察也仅限于强酸强碱的单一pH。因此有必要扩大阪崎肠杆菌耐热性、耐酸碱性的受试范围，并结合耐药性指导食品安全生产和感染病例的治疗。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 来自重庆市市售配方奶粉、米粉、面条等婴幼儿食品中分离的8 株阪崎肠杆菌ES1～ES8，所有菌株均通过API 20E 和VITEK2 生化鉴定为ES;阳性对照菌株阪崎肠杆菌ATCC29544;药敏质控菌株大肠杆菌ATCC25922;阪崎肠杆菌显色培养基(OXOID);胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基 北京陆桥;Mueller-Hinton 琼脂 OXOID;药敏试纸片OXOID，按美国国家临床实验室标准化委员会(the National Committee of Clinical Laboratory Standard，NCCLS)推荐的肠杆菌药敏实验抗生素选择原则，并结合相关研究，选用包括万古霉素等共10 大类19 种抗生素，名称及浓度见表1。

表1 纸片扩散法测定阪崎肠杆菌耐药性所用抗生素Table 1 Antibiotics used in the susceptibility testing of Enterobacter sakazakii by disk diffusion

浊度仪 美国HACH 公司;恒温水浴箱 北京长风公司;高压灭菌锅 日本HIRIYAMA 公司;移液枪 法国GILSON 公司;孵箱 日本三机电国际贸易公司;游标卡尺 成都量具刃具股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 阪崎肠杆菌耐热性实验［3-4］将复苏增殖的阪崎肠杆菌制成均匀的菌悬液，使其浓度控制在约107cfu/mL。将装有10mL 灭菌生理盐水的试管放入水浴锅中进行升温，平衡一段时间后，吸取1μL 的阪崎肠杆菌菌悬液加入试管中，使其分别在50、55、60、65℃水浴条件下处理1、2、3、5、8、10、20、30、60min 后取出。待冷却至室温后，摇匀，分别吸取处理后的菌液10μL，均匀涂布于TSA 培养基上，37℃倒置培养过夜后，观察阪崎肠杆菌的生长情况。

1.2.2 阪崎肠杆菌耐酸碱性实验［4］配制pH 分别为1.0、1.5、2.0、12.0、12.5、13.0 的生理盐水，每只试管分装10mL，灭菌后备用。将复苏增殖的阪崎肠杆菌制成均匀的菌悬液，使其浓度控制在约107cfu/mL。取1μL 的阪崎肠杆菌菌悬液加入不同pH 的生理盐水试管中，使其分别在pH1.0、1.5、2.0、12.0、12.5、13.0条件下处理0、30、60、90、120s。到达处理时间后立即摇匀，然后吸取10μL 菌液，均匀涂布于TSA 培养基上，37℃倒置培养过夜后，观察阪崎肠杆菌的生长情况。

1.2.3 阪崎肠杆菌耐药性实验 采用NCCLS 推荐的纸片扩散法进行阪崎肠杆菌的药敏实验。从营养琼脂上挑取单菌落于无菌生理盐水中制成浊度为0.5个麦氏单位的菌悬液。用无菌棉拭子蘸取菌悬液均匀涂布于MH 琼脂上，接种15min 内用镊子将药敏试纸片均匀分布于90cm2平皿内，每个平皿内放置4 个试纸片。将平板置于36℃孵箱内培养16～20h，取出后用游标卡尺测量读取抑菌圈直径，参照NCCLS 药敏标准对肠杆菌科抑菌圈直径的解释标准进行结果判定。

2 结果与分析

2.1 阪崎肠杆菌的温度耐受性

各菌株的耐热性实验结果如表2 所示。如表所示，当作用温度为50℃时，除ES1、ES3、ES6 在60min作用后失活外，其他菌株均保持一定的活性;当作用温度为55℃时，ES5 作用1min 后即失活，而ES2 在作用30min 后仍可存活，其余菌株基本在8min 后就可被灭活;当温度为60℃时，仅ES2 能在前几分钟内保持一定的活性，5min 后可被灭活;而当温度升至65℃时，所有菌株均可被立即灭活。由此可见，9 株实验菌株中，ES2 对温度的耐受性最强，而ES5 的耐热性较差。随作用温度的升高和作用时间的延长，所有菌株的活性均有不同程度的降低，为防止某些耐热性较好菌株的存活，在生产和日常生活中至少应采用60℃作用5min 以上的条件对婴幼儿食品和用具进行杀菌消毒。

2.2 阪崎肠杆菌的酸碱耐受性

结果显示，所有实验菌株在pH 为2.0、12.0、12.5下均可存活，但平皿上的菌落数量随着作用时间的延长而减少。各菌株在pH 为1.0、1.5、13.0 下的存活情况有所差异，各菌株在pH 为1.0、1.5、13.0 下的存活情况如表3 所示。

如表3 所示，除标准菌株29544 外，其余菌株在pH1.0 和pH13.0 的强酸强碱处理下会立即死亡，证明强酸强碱能有效杀死阪崎肠杆菌。通过比较酸碱条件下实验菌株的存活情况，阪崎肠杆菌对碱的整体耐受性要强于酸的耐受性。ES6 对酸的耐受性最强，当pH 为1.5 时，作用90s 时仍有活菌存在，而其他菌株在作用90s 后基本可以全部被灭活，由此可知不同菌株对酸碱度的耐受性也存在一定的差异。此外，当pH 为2.0、12.0 和12.5 时所有菌株均可存活，但存活数量会随作用时间的延长而减少，且各菌株间的存活数量存在一定的差异。

2.3 阪崎肠杆菌的耐药性

如表4 所示，药敏实验结果表明9 株阪崎肠杆菌对抗生素的敏感性基本一致，对青霉素、苯唑西林和万古霉素3 种抗生素均有耐药性，对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、美洛培南、氨曲南、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、四环素、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氯霉素14 种抗生素均敏感。另外，仅ES6 对头孢噻吩的敏感性处于中介值，其余菌株均为耐药，仅ES4 对萘啶酸的敏感性处于中介值，其余菌株均为敏感。根据实验结果分析可知，阪崎肠杆菌重庆市食品分离株的多重耐药性主要可分为2 种类型:Ⅰ型耐药谱为PEN+OXA +KF+VA，占88.89%，Ⅱ型耐药谱为PEN +OXA +VA，占11.11%。

表2 温度耐受实验结果Table 2 Results of anti-thermal test

表3 酸碱耐受性实验结果Table 3 Results of anti-acid and anti-alkaline test

表4 阪崎肠杆菌抗生素敏感性分布(n=9)Table 4 Antibiotic susceptibility of Enterobacter sakazakii(n=9)

3 结论

3.1 阪崎肠杆菌是近年来在食品生产、保存、运输和销售中较为活跃的一种病源微生物，人们对其关注度的提高与其对幼儿感染事件的频发性有着密切的联系，食用阪崎肠杆菌污染的婴幼儿食品会致使免疫力低下及出生体重较低新生儿罹患败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎［5］。欧美国家已报道了多起婴幼儿阪崎肠杆菌的感染病例，我国相关病例的报道较少，主要还集中于对市售奶制品阪崎肠杆菌的检出率报道，其中2004 年安徽阜阳发生的劣质奶粉事件中，阪崎肠杆菌的检出率已达12.6%［6］。目前，对阪崎肠杆菌进行耐受性的研究报道较少，有必要研究了解阪崎肠杆菌对温度、酸碱和抗生素的耐受性，以此指导食品生产和加工的卫生和安全控制。

3.2 研究表明阪崎肠杆菌能形成一种菌毛结构的保护层，促使菌体间形成共生集合体，从而对高温、清洁剂、杀菌剂和抗生素等产生很强的抵抗力［7］。Farber 等发现经72℃处理的配方奶粉中仍有存活的阪崎肠杆菌［8］，胃酸环境(pH0.9～2.0)中亦有部分阪崎肠杆菌没有灭活。对温度、酸性环境的极强耐受性使得某些阪崎肠杆菌在奶粉加工、包装、储运、冲调和人胃等环境中均可存活并造成污染，引发疾病。本研究中，某些阪崎肠杆菌分离株对温度和酸碱性具有较高的耐受性，从整体水平上看，采用60℃处理5min 或65℃处理短时可被灭活。在pH 为1.0 和13.0 的强酸强碱条件均有较好的杀菌效果，pH1.5 条件下作用90s 以上亦可使阪崎肠杆菌全部灭活。比较而言，阪崎肠杆菌对碱的耐受性要强于酸。另外，对温度和酸碱度的最强或最弱耐受性并未集中表现在同一菌株上，这表明阪崎肠杆菌对温度和酸碱度的耐受性并没有明显的关联。本研究中的9 株阪崎肠杆菌对19 种抗生素的敏感性较为一致，与其他研究结果相比，耐药性较低［9-10］，这可能与本研究中所实验抗生素种类较少、菌株数量较少、菌株来源较为单一等因素有关。所有菌株均对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、美洛培南、氨曲南、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、四环素、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氯霉素14 种抗生素均敏感。由于某些抗生素对婴幼儿的骨关节软组织和骨骼生长具有损伤作用，因此临床使用时应结合药物毒性和药物敏感性等多方面因素进行综合考量［11］。结合本研究的实验结果分析，采用巴氏消毒法，即牛奶经62 ～65℃处理30min 或72 ～75℃处理15s，基本可以杀死大部分的阪崎肠杆菌，但并不能排除某些耐受性极强菌株存活的可能性。因此，采用超高温瞬时杀菌法，即将牛奶加热至135℃保持2～4s的方式更为安全可靠。对于家庭操作而言，则应尽量采用70℃以上较高温度的水来冲调奶粉。另外，对于生产加工和冲调环境的清洁，建议采用强酸性的杀菌剂或清洁剂，这样可以有效降低奶粉和环境中微生物的存活率，从而防止阪崎肠杆菌污染的发生。

3.3 阪崎肠杆菌在环境和食品中的分布范围十分广泛，不仅能污染牛奶、蔬菜、生肉等食品，而且在奶粉的生产、包装及奶粉的冲调环境中均可检出。近年来有关奶粉的食品安全事件频频发生，提醒人们必须重视对奶粉等婴幼儿食品的质量控制。作为奶粉中易污染、危害大的阪崎肠杆菌而言，分析研究其耐受性能指导和改进食品生产企业的卫生条件，协助HACCP 等操作规范的顺利实施，有效降低阪崎肠杆菌的污染水平。除此之外，对消费者也有教育和指导意义，明确阪崎肠杆菌的耐受性，可以提示消费者在奶粉冲配时采用适当的温度、对冲调环境进行清洁，对感染病例还具有用药指导作用。因此研究阪崎肠杆菌的耐受性对食品生产和食品质量控制是十分重要的。另外，随着分子生物学技术的不断发展，有必要建立健全以PFGE 等分子分型技术为核心的食源性致病菌溯源分析体系，美国等国家已经建立了有关的溯源数据库，我国的相关工作也在展开。但对于食源性致病菌溯源体系的建立多局限于生理生化反应和分子分型等方面的信息，缺少对菌种耐受性等表型特征的记录。所以，研究阪崎肠杆菌耐受性特征不仅能弥补菌种信息的不足，还能更好地指导食品生产，防治污染、控制传播，保证食品安全。

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