气相色谱法测定鸡精中2种氯丙醇的方法研究

黄 琦，季晓娟，王丹丹

（1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州310023；2.浙江省食品药品检验研究院，杭州310004）

氯丙醇是国际公认的食品污染物，氯丙醇的污染主要来源于酸水解植物蛋白（HVP），而HVP被广泛应用于各种调味品。蛋白水解物中氯丙醇的种类有：3－氯－1，2－丙二醇（3－MCPD）、2－氯－1，3－丙二醇（2－MCPD）、1，3－二氯－2－丙醇（1，3－DCP）和2，3－二氯－1－丙醇（2，3－DCP）。其中3－MCPD和1，3－DCP是主要检测的对象。毒理学研究表明3－MCPD有致癌性、遗传毒性、生殖毒性、神经毒性和免疫毒性等，是氯丙醇中的主要成分［1］。WHO/FAO食品添加剂联合专家委员会（JECFA）提出，3－MCPD的暂定每日最大耐受摄入量（PMTDI）为2μg（以每千克体质量计），认为1，3－DCP为遗传毒性致癌物，目前不宜制订每日耐受量（TDI）［2］。许多国家已经制订了HVP和酱油中3－MCPD的限量标准，欧盟要求HVP和酱油中的3－MCPD低于20μg/kg，德国和澳大利亚规定1，3－DCP应低于50μg/kg［3］。目前，对氯丙醇的研究主要集中在日常生活中用到的酱油［4－6］，而鸡精作为常用调味品之一报道较少。氯丙醇定量的主要方法是气相色谱－质谱联用法，该法灵敏度高，专属性好，但是需要采用同位素内标定量，操作繁琐，成本较高，而且仪器价格昂贵，难以普及。本试验采用基质固相分散萃取法（MSPD）提取、净化样品，用七氟丁酰基咪唑（HFBI）衍生化，建立气相色谱－电子捕获检测器（GC－ECD）测定鸡精中3－MCPD和1，3－DCP的方法。实验表明，该方法简便易行，灵敏度高，结果令人满意，具有较强的实用性。

1 材料与仪器

3－MCPD和1，3－DCP（纯度≥99.0%）：德国 Merck公司，HFBI：美国Pierce公司；ExtrelutTM20硅藻土填料：德国Merck公司；正己烷（色谱纯）：美国Sigma公司；乙醚为分析纯，重蒸后使用；氯化钠和无水硫酸钠为分析纯，经过600℃灼烧4h后得到；水为超纯水；鸡精购于本地超市；除非另有说明，实验所用试剂均为分析纯。

岛津GC－14C型气相色谱仪配电子捕获检测器（ECD）：日本岛津公司，色谱柱：J＆WDB－5（30m×0.32mm×0.25μm），玻璃层析柱（40cm×2cm），旋转蒸发器，氮气蒸发器，恒温箱，涡漩混合器，1mL气密针。

2 试验部分

2.1 样品的提取、净化

称取试样2.00g，置100mL烧杯中，加饱和氯化钠溶液（称取氯化钠290g，加水溶解并稀释至1 000mL）6g，超声15min。加入5g ExtrelutTM20硅藻土柱填料，搅拌均匀后，装入已依次充填1cm高的无水硫酸钠和5g ExtrelutTM20的玻璃层析柱中，压实，再填入1cm高的无水硫酸钠，放置15min后，用正己烷洗脱去除脂溶性杂质，并弃去。用乙醚140mL洗脱，流速约5mL/min，收集乙醚洗脱液。在收集的乙醚洗脱液中加无水硫酸钠15g，振摇，放置10min后，过滤，滤液于40℃温度下旋转蒸发至约0.5mL（切勿蒸干），转移至约5mL具塞试管中，用正己烷洗涤旋转蒸发瓶，合并洗涤液至试管中，并用正己烷稀释至刻度。

2.2 衍生化

将上述试样提取液在室温下用氮气浓缩至2.0mL，用气密针迅速加入HFBI 50μL，立即密塞。涡旋充分混合后，于75℃下保温30min。取出后，放置至室温，加饱和氯化钠溶液3mL；涡旋混合0.5min，静置使两相分离。取上层正己烷加无水硫酸钠约0.3g干燥，静置5min，供气相色谱分析测定［3］。

2.3 标准溶液的配置

分别准确称取3－MCPD和1，3－DCP标准品25mg（有效成分），分别置于2个25mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，得质量浓度为1000mg/L的标准储备液。用正己烷稀释10倍，配制100mg/L中间溶液，最后用正己烷配成质量浓度为0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mg/L的混合标准溶液系列。取上述混合标准溶液系列各0.2mL，用正己烷定容至2.0mL，用气密针迅速加入HFBI 50μL，立即密塞，振匀。接下来的步骤与样品的衍生化方法相同，得到质量浓度范围在0.010～0.250mg/L的标准系列HFBI衍生物溶液。

2.4 气相色谱条件

DB－5石英毛细管柱，30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度为240℃，检测器温度为280℃；色谱柱温度初温为60℃，保持1min，以4℃/min升至100℃，保持1min，再以30℃/min升至250℃，并保持5min；载气为高纯氮气，流速为2.0mL/min；进样方式为不分流进样，进样量1.0μL；峰面积外标法定量。

3 结果与讨论

3.1 样品提取净化条件的选择

样品纯化时，需要清除基质中的色素、脂肪和蛋白质，而氯丙醇在极性溶剂和非极性溶剂中都有良好的溶解性，所以液液提取方法很难有效进行，必须采用固相提取技术［7］。试验考察了氧化铝、硅胶、ExtrelutTM20硅藻土3种吸附剂对样品的吸附作用，结果表明，ExtrelutTM20硅藻土效果最佳，其稳定性好、重现性好，具有很好的吸水性。装柱时比较了2种方式：一是常规方式用ExtrelutTM20硅藻土装柱；二是把该ExtrelutTM20硅藻土一半先装柱，另一半与样品混合均匀后再装柱。试验结果表明，后者更加有利于提取操作。

采用有机溶剂预洗脱去除样品中的脂溶性杂质和色素等，可减少衍生时的干扰及对色谱柱进样口的污染。试验表明，仅测定3－MCPD时可用正己烷－乙醚（体积比9∶1）洗脱去除脂溶性杂质，但是1，3－DCP有较大的损失（≥30%），采用正己烷预洗脱即可避免损失。

洗脱氯丙醇常用乙醚或乙酸乙酯［7］。通过试验比较了这2种洗脱溶剂，回收率如表1所示。结果表明，采用乙酸乙酯洗脱，用量较大，且杂峰太多，而采用乙醚洗脱，效果较好。采用140mL乙醚洗脱，回收率可达98.2%以上。洗脱液含有水分会影响后续的衍生化，采用无水硫酸钠干燥，效果较好，而采用硫酸镁、硫酸钙、氧化钙等干燥会引起较大的损失。

表1 2种洗脱溶剂的回收率（n＝6）Table 1 Recoveries of 2elution solvents（n＝6）

3.2 衍生化方法的选择

3.2.1 衍生化试剂的选择

氯丙醇的极性较大、蒸气压低、沸点较高，衍生化后可以提高分析物的挥发性及检测的灵敏度。可供使用的衍生化试剂有七氟丁酰试剂 （HFBI、HFBA）、硼酸类（丁基硼酸、苯基硼酸）、丙酮或庚酮、三氟乙酸酐（TFAA）、N，O－双三甲基－三氟乙酰胺（BSTFA）等试剂。硼酸类、丙酮只能衍生3－MCPD等双羟基醇类化合物；TFAA比HFBI的衍生反应容易进行，但产生的有机酸可能会分解氯丙醇衍生物，且灵敏度不如HFBI衍生物高；七氟丁酸酐（HFBA）虽然在室温下就可以反应，但是副产物七氟丁酸可能会降解氯丙醇衍生物；BSTFA主要用于氢火焰离子化检测器（FID）［8］。相比之下，采用HFBI衍生后氯丙醇的电负性明显增强，且HFBI衍生的化合物比较稳定、检测灵敏度较高。

3.2.2 衍生化条件的选择

分别选择60、70、80、90℃等不同的衍生化温度，该衍生化反应在70～80℃效果最佳，最终选择75℃为衍生化温度；在该温度下分别衍生20、30、40、50min，结果表明，衍生时间大于30min后，峰面积增加不明显，因此选择反应时间30min。在选定的衍生化时间及温度下，分别加入40、50、60、70μL的衍生化试剂，试验发现50μL的HFBI已完全满足要求。由于HFBI遇水迅速反应，因此环境的湿度影响极大，使用过程中需注意防潮。在相对湿度超过70%时，需用气密针迅速加入衍生化试剂。衍生后加入饱和氯化钠或蒸馏水除去过量衍生剂、副产物。

3.3 色谱条件的选择

衍生化后的氯丙醇可用非极性柱或弱极性柱分析。比较了实验室的2种色谱柱DB－1色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm）和DB－5色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm），均能满足分析要求；但是采用DB－5柱分析，峰形好，出峰快，因此选用DB－5色谱柱。为使杂质峰和主峰获得较好的分离效果和合适的保留时间，必须采用程序升温方式。经多次试验，所选条件同2.4。在该色谱条件下，3－MCPD和1，3－DCP的保留时间分别为约7.23min和11.85min。衍生化后的3－MCPD和1，3－DCP标准溶液色谱图见图1，含氯丙醇的鸡精样品色谱图见图2。

图1 3－MCPD和1，3－DCP标准HFBI衍生物气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of HFBI derivatives of 3－MCPD and 1，3－DCP standards

图2 鸡精样品中3－MCPD和1，3－DCP的HFBI衍生物气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of HFBI derivatives of 3－MCPD and 1，3－DCP in chicken essence

3.4 线性关系及检测限

分别取混合标准系列HFBI衍生物溶液1.0μL进样测定。分别以3－MCPD和1，3－DCP的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。3－MCPD的回归方程为：Y＝1 136 457X－412.62，相关系数为0.999 1；1，3－DCP的回归方程为：Y＝138 739X－337.15，相关系数为0.999 3。结果表明，2种氯丙醇在0.010～0.250mg/L范围内，线性关系良好。经多次试验，该方法测定3－MCPD和1，3－DCP的定量限均为0.01mg/kg，能满足检测和定量分析的要求。以3倍基线噪音计算，方法的检测限均为0.005mg/kg。

3.5 加标回收率试验和方法精密度

取3－MCPD和1，3－DCP空白的鸡精样品作为基质，分别测定0.05、0.10和0.20mg/kg 3种添标水平下3－MCPD和1，3－DCP的加标回收率，并计算相对标准偏差。每个水平测定6次，回收率及精密度结果见表2。结果表明，3－MCPD的回收率在95.7%～102.2%范围内；1，3－DCP的回收率在94.5%～99.3%范围内，两者相对标准偏差均小于5.0%。该方法具有较好的准确度和精密度，符合氯丙醇污染测定的技术要求。

表2 方法的回收率和精密度（n＝6）Table 2 Recovery and precision of method（n＝6）

3.6 鸡精样品检测

采用建立的试验方法对市场上12种品牌（每种品牌10批），共120份鸡精产品进行测定，共有4个品牌的21份鸡精样品中检出3－MCPD，检出率为17.5%，其中4份质量浓度超过20μg/kg；有3个品牌13份鸡精样品中检出1，3－DCP，检出率为10.8%，质量浓度均未超过20μg/kg。

4 结 语

本试验所建立的方法能同时测定鸡精中3－MCPD和1，3－DCP的质量浓度，方法灵敏度较高，回收率较高，相对偏差较小，可以准确地测定鸡精中2种氯丙醇的质量浓度；方法定量限0.01mg/kg，能满足鸡精中2种氯丙醇限量检测的要求；试验所用仪器易于普及，便于推广应用，是一种较理想的分析方法。本方法也适用于其他调味品和存在氯丙醇污染的食品中3－MCPD和1，3－DCP的限量测定。

［1］Baer I，De La Calle B，Taylor P.3－MCPD in food other than soy sauce or hydrolysed vegetable protein（HVP）［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，396（1）：443－456.

［2］FAO，WHO.Summary of the fifty－seventh meeting of the joint FAO/WHO expert committee on food additives［Z］.Rome：FAO/WHO，2001：20－21.

［3］GB/T 5009.191—2006，食品中氯丙醇含量的测定［S］.

［4］赵文杰，卢奎，冯业振.气相色谱－电子捕获检测法测定酱油中1，3－二氯－2－丙醇的含量［J］.食品科技，2010，35（11）：285－288.

［5］周相娟，谢精精，赵玉琪，等.气相色谱－质谱法测定酱油中氯丙醇类化合物［J］.中国调味品，2011，36（5）：88－90，120.

［6］Xu X M，Ren Y P，Wu P G，et al.The simultaneous separation and determination of chloropropanols in soy sauce and other flavoring with gas chromatography－mass spectrometry in negative chemical and electron impact ionization modes［J］.Food Additives and Contaminants，2006，23（2）：110－119.

［7］赵广西，杜伟，刘浩，等.酱油中氯丙醇测定的注意事项［J］.中国调味品，2011，36（9）：23－25.

［8］傅武胜，吴永宁.食品中氯丙醇测定方法研究进展［J］.食品科学，2007，28（3）：353－357.