液相色谱法测定洋甘菊中芹菜苷质量浓度研究

陈丽春，王菲菲

（1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州310023）

洋甘菊又称母菊，主要分德国洋甘菊和罗马洋甘菊两种。为菊科甘菊属的花序或全草，一年生或两年生草本植物。主要产于东欧、埃及、北美、比利时、英国等国家，为一种重要的药用植物和香料植物。洋甘菊在欧洲、美国及日本等地早已被广泛利用，成为众所周知的药用植物和香料植物，不少国家加以大面积机械化生产。洋甘菊花朵具有水果香，主要含有挥发油、黄酮类、愈创薁内酯、香豆素类等成分。作为一种引进植物，洋甘菊在中国尚未得到充分的开发及利用［1－3］。大量的实验表明，洋甘菊具有消炎、抑制真菌、解痉等作用［4－6］，具有显著的社会经济效益。

芹菜苷为洋甘菊中的一种活性黄酮类物质［7］，可作为平滑肌的解痉剂，醛糖还原酶抑制剂和镇静剂。由于对洋甘菊中芹菜苷质量浓度的研究较少，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）［8－11］建立了HPLC测定芹菜苷质量浓度的方法，为更好地研究洋甘菊的药用价值和具体成分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芹菜苷标准品（批号20110908，上海永恒生物科技有限公司），色谱甲醇（Tedia，United States of America），优级纯乙酸（上海国药集团化学试剂有限公司），其他试剂均为分析纯，洋甘菊（新疆种植，购于杭州滨江艺福堂）。

1.2 仪器与设备

仪器设备：日本岛津高效液相色谱仪（型号规格：LC－20AD，配有SPD－20A可变波长紫外检测器，CTO－20A柱温箱，手动进样阀），超纯水器（Direct－Q®3，MILLIPORE，made in France），KQ－50E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），玻璃砂芯过滤装置（上海兴亚净化材料厂），GZX－9076MBE电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司）。

1.3 标准品储备液和供试品的制备

标准品储备液的配置：精密称取5.05mg芹菜苷标准品（质量分数大于99%），用色谱级甲醇溶解配置质量浓度为0.499 95mg/mL芹菜苷标准品储备液，摇匀，用0.22μm膜过滤。根据实验需要，稀释配成所需质量浓度。

供试品的制备：精密称取干燥洋甘菊（过40目筛）126.4g，以70%乙醇，料液比为1∶18，在70℃下回流浸提2.5h，抽滤，再称定质量，70%乙醇补足失重，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）过滤，取续滤液，即得。

1.4 色谱条件

色谱柱：依利特Sinochrom ODS－BP柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇（A）－1%乙酸水溶液（B），洗脱条件为：V（A）∶V（B）＝40∶60；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测（紫外）波长：333nm；进样量：10μL。

2 结果与分析

2.1 方法学试验

2.1.1 线性关系考察

用移液枪精密量取上述标准品储备液配置成质量浓度分别为0.999 9、1.999 8、3.999 6、4.999 5、24.997 5、39.996 0、49.995 0、99.990 0μg/mL的标准品溶液。在上述色谱条件下检测峰面积，平行测定5次，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，绘制标准曲线。芹菜苷的线性回归方程为：y＝41 616x－3 013.3，R2＝0.999 9。结果表明，芹菜苷在0.999 9～99.99μg/mL间线性关系良好（图1）。

图1 芹菜苷标准曲线图Fig.1 Standard curve of apigenin

2.1.2 精密度考察

日内精密度：在上述色谱条件下，将2.999 7μg/mL的标准品溶液在0、2、4、6、8h，进行测定，记录色谱峰面积，连续进样5次，测定峰面积，计算峰面积的RSD%＝1.68%。

日间精密度：在上述色谱条件下，将对照品溶液连续3d，每天进样2次，测定峰面积，计算峰面积的RSD%＝1.94%。结果表明，此方法的精密度良好。

2.1.3 重现性考察

取洋苷菊提取液1mL置于10mL容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，平行制备5份溶液，分别取适量溶液于1.5mL进样瓶中，用0.45μm微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下进行HPLC分析，分别测定峰面积，计算峰面积的RSD%＝2.11%。结果表明，此方法的重复性良好。

2.1.4 稳定性考察

取一份样品溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，取适量溶液于1.5mL进样瓶中，分别在0、2、4、8、12、24h进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，分别进行峰面积的测定，计算峰面积的RSD%＝2.28%。结果表明，此方法在室温下24h内的稳定性良好。

2.1.5 加样回收试验

取1mL洋甘菊提取物，稀释10倍定容，加入芹菜苷标准品37.3μg，用5mL的容量瓶定容，即为加标试样。平行制备5组溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下进行HPLC分析，分别测定峰面积，从而计算平均回收率为1.04%，RSD%＝1.87%（表1）。

表1 芹菜苷加样回收试验结果Table 1 Sample recovery test of apigenin

3 分析与讨论

3.1 样品的测定与分析

在上述色谱条件下进行HPLC分析，测定峰面积，保留时间在23.748min处为芹菜苷，代入标准曲线计算芹菜苷的质量浓度。测得芹菜苷在洋甘菊中的质量浓度为83.205mg/L（图2，图3）。

图2 洋甘菊提取物的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of chamomile extract

图3 洋甘菊提取物加芹菜苷标准品的HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatogram of chamomile extract adding apigenin standard substance

3.2 讨 论

3.2.1 提取溶剂的选择

本研究考察了乙醇－水混合溶剂作为提取溶剂对提取效果的影响。结果发现，当乙醇与水体积比为70∶30时，提取效果较好，芹菜苷质量浓度较高。因此，选用了乙醇与水体积比为70∶30。

3.2.2 检测波长的选择

用UV－5500PC型紫外/可见分光光度计进行全波长扫描发现，芹菜苷在267nm和333nm处有特征吸收峰，其在333nm处吸收峰达最大。所以，本次实验选取的检测波长为333nm。

3.2.3 流动相比例的选择

查阅相关文献，经过比较选择了甲醇－乙酸为流动相，考察了不同比例甲醇－乙酸对芹菜苷和其他组分的分离情况。发现甲醇与1%乙酸的体积比为40∶60时，芹菜苷能与其他组分完全分离。

4 结 语

试验结果表明，该HPLC方法稳定，测得结果准确，重复性好，能用于测定洋甘菊中芹菜苷的质量浓度。对所测得数据进行分析可得，洋甘菊中芹菜苷的质量浓度较低，资料显示芹菜中有着较高的芹菜苷的质量浓度。另外在样品的提取时，通过对原料和产品的检测发现，大孔树脂能起到初步富集洋甘菊中芹菜苷的作用，且AB－8型大孔树脂效果最好。

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