一株产高温纤维素酶真菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

严芬，李源涛，李丽莎，林娟

(福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350116)

0 引言

纤维素酶是对纤维素进行降解利用的一组酶的总称，由内切葡聚糖苷酶(endo－1，4－β－D－glucanase，EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖苷酶(exo－1，4 －β －D －glucanase，EC 3.2.1.19)和 β －葡萄糖苷酶(β－1，4－glucosidase，EC 3.2.1.21)组成.纤维素类物质是地球上最丰富的可再生资源之一，目前自然界中的纤维素绝大多数没有得到有效利用，造成环境污染.因此，利用纤维素酶对其进行生物转化对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义［1－2］.除此以外，纤维素酶还在造纸、洗涤剂、纺织、动物饲料和制药等领域有着重要的应用价值［3－5］.

目前报道较多的纤维素酶生产菌株主要集中在胞外酶活力较高的木霉属 (Trichoderma)、青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)，其中里氏木霉(T.reesei)的相关研究最多［6］.但目前这些真菌所产的纤维素酶与大规模商品化生产的淀粉酶(或蛋白酶)相比，还存在着生产规模小、酶的活力低及耐热性差等问题［7］.其中纤维素酶耐热性差的问题会导致其在高温催化过程中活性降低并最终失活，需要进行多次补加才能完成酶解过程，大大增加了生产成本，在很大程度上制约着纤维素酶的应用，因此耐热纤维素酶高产菌株的选育以及其机制的研究成为当前的热点［8－9］.本研究分离到一株产高温纤维素酶且pH稳定性较好的土曲霉XM5，对其酶学性质进行了初步研究，有望为高温纤维素酶的工业化生产及应用提供优良菌株.

1 材料与方法

1.1 样品来源

采自造纸厂的污泥.

1.2 培养基

富集培养基 (g· L－1)［10］:CMC － Na 10.0;K2HPO41.0;Na2CO35.0;MgSO4·7H2O 0.1;FeSO4·7H2O 0.15;蛋白胨5.0;酵母浸出粉10.0;pH值自然.

初筛分离培养基(g·L－1):CMC － Na 2.0;K2HPO41.0;Na2NO32.0;MgSO4·7H2O 0.5;KCl 0.5;蛋白胨2.0;琼脂20.0;pH值自然.滤纸液体培养基(g·L－1):滤纸10.0;NH4NO35.0;酵母膏 3.0;MgSO4·7H2O 0.5;KH2PO41.0;液体产酶鉴定培养基(g·L－1):CMC －Na 10.0;蛋白胨 3.0;酵母膏0.2;(NH4)2SO42.0;KH2PO44.0;MgSO4·7H2O 0.3;pH 值自然.

稻草发酵培养基(g·L－1):稻草(0.6 ～0.12 mm)20.0;(NH4)2SO43.5;蛋白胨 2.0;NaCl 2.0;KH2PO44.0;MgSO4·7H2O 0.5;甘油 2.0，pH 值自然.

种子培养基(g·L－1):土豆200.0;葡萄糖20.0;pH值自然.

1.3 菌株分离方法

1)菌株的初筛.将5 g采集的样品加入到装有玻璃珠的三角瓶中并加入50 mL的无菌水充分震荡摇匀，取5 mL加入到装有50 mL富集培养基的三角瓶中，37℃条件下振荡培养3 d，连续富集培养2次.取富集后上清液1 mL，用0.9%无菌生理盐水梯度稀释后涂布于初筛分离培养基平板上，37℃培养3 d，挑取长势较大的单菌落进行划线分离纯化.将纯化得到的单菌落点样于新的CMC平板上培养3 d，采用革兰氏碘液染色［11］的方法进行观察并记录透明圈直径与菌落直径大小，以二者比值较大的菌株进行保藏并接入滤纸液体培养基中37℃培养5 d，记录其降解溃烂情况.

2)菌株的复筛.将初筛得到的菌株接入种子液中37℃培养2～3 d，以6%的接种量接入到稻草发酵培养基中振荡培养，37℃培养5 d，取发酵液进行酶活测定，从中筛选出产酶活性最高的菌株.

1.4 菌株的鉴定

1)菌株形态鉴定.依据《真菌鉴定手册》进行菌落特征和菌丝体形态特征的鉴定［12］.

2)菌株rDNA ITS序列分析.采用通用型基因组DNA提取试剂盒(NO:DV811A，大连宝生物有限公司)进行菌株基因组DNA的提取.以菌株的DNA作为PCR扩增的模板，引物为ITS1(5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG －3’)和 ITS4(5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3’).PCR 反应体系(50 μL)为:10×Reaction Buffer 5 μL，模板 2 μL，dNTP Mixture(各 2.5 mmol·L－1)4 μL，正向引物(10 μmol·L－1)2 μL，反向引物(10 μmol·L－1)2 μL，2U BioReady rTaq 0.6 μL，ddH2O 34.4 μL.反应条件为:94 ℃预变性180 s，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，34个循环后72℃稳定延伸600 s.通过扩增获得ITS部分序列，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果后，将PCR产物割胶回收纯化并送Takara公司测序.

3)菌株系统发育分析.将测序结果输入NCBI中用Blast程序进行序列同源性比较分析，选取与该菌株同源性较高的菌株用于系统发育树的构建，首先使用Clustal X进行多重序列匹配排列矩阵，使用Mega 5.05［13］软件以Neighbor－Joining计算方式生成系统发育进化树，系统树各分枝的置信度经重抽样法(Bootstrap)1 000次重复检测.

1.5 菌株XM5的发酵产酶特性

1)种子培养及发酵.将在PDA平板上活化好的菌株XM5，接种于种子培养基中(100 mL/250 mL)，于37℃、150 r·min－1条件下培养24 h，作为种子液.以6%的接种量接入以稻草为唯一碳源的发酵培养基中于37℃、150 r·min－1条件下进行摇瓶发酵.

2)菌株XM5生长和产酶曲线.发酵过程中(10 d)每隔24 h取样一次，将培养液于8 000 r·min－1条件下离心10 min，取沉淀称湿重［14］并测定发酵液中的CMC酶活和FPA酶活力，以未接种的培养液采用同样的方法处理作为空白对照.

3)羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力的测定［15］.发酵液于4 000 r·min－1条件下离心10 min，取上清液作为粗酶液.经适量稀释后取0.5 mL，加入含 1%CMC －Na的醋酸缓冲液(pH 4.8，0.1 mol·L－1)1.5 mL，经50℃恒温水浴30 min后，立即按DNS法测定还原糖(加入2 mL DNS显色液，沸水浴中显色10 min后.快速冷却终止反应，540 nm处测定OD值，空白先加DNS再加酶液，其它步骤相同，对比标准曲线计算酶活).一个酶活力单位(U)定义为每分钟催化底物水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量.

4)滤纸酶(FPA酶)活力的测定［15］.取0.5 mL适当稀释的发酵上清液，加入1张滤纸条(Whatman No.1，1 cm ×6 cm，约50 mg)及醋酸缓冲液(pH 4.8，0.1 mol·L－1)1.5 mL，经50 ℃恒温水浴 30 min 后，立即按DNS法测定还原糖(加入2 mL DNS显色液，沸水浴中显色10 min后，快速冷却终止反应.540 nm处测定OD值，空白先加DNS再加酶液，其它步骤相同，对比标准曲线计算酶活).一个酶活力单位(U)定义为每分钟催化底物水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量.

1.6 菌株XM5产纤维素酶酶学性质研究

1)温度对CMC酶和FPA酶酶活力的影响.取一定量的酶液，测定不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)时的CMC酶和FPA酶酶活力，确定最适反应温度.

2)CMC酶和FPA酶的温度稳定性试验.将粗酶液分别置于不同温度(40、50、60、70、80℃)水浴中保温2 h，然后迅速冷却至最适反应温度，在最适反应温度下反应30 min，测定CMC酶和FPA酶的残留活力，未处理的粗酶液酶活力为100%.

3)pH 对 CMC 酶和FPA 酶酶活力的影响.将粗酶液分别与pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的CMC底物在50℃下反应30 min，测定CMC酶和FPA酶活力.

4)CMC 酶和 FPA 酶的pH 稳定性试验.将粗酶液于 pH 为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 条件下保温3 h，取样于最适pH下测定酶活力，以未处理的粗酶液酶活力为对照，计算各pH下CMC酶和FPA酶的残余酶活百分比.

2 结果与分析

2.1 筛选结果

与传统的刚果红染色法相比，菌种初筛时采用革兰氏碘液染色法［11］具有快速简便的特点，能有效提高初筛的准确度.经过筛选培养基初筛获得11株透明圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大(D/d值大于1.30)且能使滤纸条发生一定程度溃烂的菌株(见图1).对初筛获得的菌株进行发酵培养，测定其酶活力，结果表明，菌株XM5相对其它菌株具有较高CMC酶活力(1.13 U·mL－1)，故选取菌株XM5做进一步研究.

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌株的形态鉴定

菌株XM5在PDA培养基上培养2 d产生呈放射状向外延伸的白色菌丝(如图2所示)，菌丝与培养基结合较牢固，整个菌落表面呈丝绒状，继而出现棕褐色分生孢子，菌落正面呈土褐色，反面呈橙黄色，培养3 d后菌落反面转为褐色.显微镜下观察(图3)，菌丝体透明有隔膜，分生孢子梗由一个直立菌丝形成，菌丝末端形成半球形的顶囊;顶囊上的初生小梗短，次生小梗长，呈放射状排列，顶端有链形孢子;分生孢子呈球形，壁光滑.

图1 菌株XM5在初筛培养基上的透明圈Fig.1 Degradatin halo of strain XM5 on CMC plate

图2 菌株XM5在PDA平板上的菌落形态Fig.2 Colony morphology of strain XM5 on the PDA plate

图3 菌株XM5的显微形态(×1 000)Fig.3 Micro－ morphology of strain XM5 under the microscope(×1 000)

2.2.2 菌株的系统发育分析

利用rDNA ITS通用引物对菌株XM5进行PCR扩增得到610 bp的目的DNA片段.将序列提交到GeneBank(登录号:KC762934)并在NCBI网站上利用Blast程序进行序列同源性搜索，结果显示，菌株XM5的ITS序列与土曲霉菌株(Aspergillus terreus strainATCC1012、Aspergillus terreus strainATCC12238等)具有高达99%的相似程度.从GeneBank比对结果中选出11株菌和XM5一起进行系统发育树的构建(图4)，由图4可以看出，XM5与Aspergillus terreus的遗传距离最近.结合菌株XM5形态学特征、ITS序列同源性和系统发育分析结果，鉴定该菌株为土曲霉属(Aspergillus terreus sp).

图4 菌株XM5 ITS序列同源性的系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree based on the homology of ITS rDNA sequences of strain XM5

2.3 菌株XM5的生长和产酶曲线

菌株XM5以6%的接种量接入以稻草为唯一碳源的液体发酵培养中培养.结果表明(图5)，从生长的第二天开始，菌体进入快速生长期，此时CMC酶和FPA酶也开始合成，其酶活力随着培养时间的增加而逐渐增大;当培养到第6 d时，菌体的生长量达到最大值(96.7 g·L－1)，CMC酶和FPA酶活力也达到最大值(分别为4.3和1.39 U·mL－1);而后继续培养，菌体生长进入衰退期，CMC酶和FPA酶活力也逐渐下降.因此，根据实验数据可推断土曲霉XM5合成纤维素酶的模式属于同步合成型.

2.4 酶学性质研究

2.4.1 最适反应温度和温度稳定性

在55～65℃内CMC酶和FPA酶活力都比较高，且在65℃时二者酶活力达到最高，超过65℃酶活力明显下降(如图6所示).温度稳定性试验结果表明(图7)，CMC酶和FPA酶在30～50℃条件下保温2 h后活力仍然维持在90%以上;CMC酶在80℃下保温2 h活力保持在53.67%;FPA酶在80℃下保温2 h后活力残留41.89%.由此可知，土曲霉XM5所产纤维素酶具有良好的温度稳定性.

图5 菌株XM5的生长和产酶曲线Fig.5 The curve between XM5 growth and cellulase production

图6 不同温度对酶活力的影响Fig.6 Effect of temperature on the crude cellulase

2.4.2 最适反应pH和pH稳定性

如图8所示，pH值小于4.0时，CMC酶和FPA酶酶活力随pH值的增大而增大，在pH值为4.0时达到最大值;而后酶活力随着pH增大而逐渐降低;pH值升至9.0时，二者的酶活力均低于20%.由此可以判断土曲霉XM5所产纤维素酶为酸性纤维素酶，其最适反应pH值为4.0.pH稳定性试验结果表明(图9)，CMC酶和FPA酶在pH值为4.0～6.0内很稳定，保温3 h后仍可保持80%以上的活力;在pH值为8.0条件下保温3 h后CMC酶活力还残留56.33%.结果表明，土曲霉XM5所产纤维素酶具有较好的pH稳定性.

图7 酶的温度稳定性试验Fig.7 Thermotolerance of the crude cellulase

图8 pH对酶活力的影响Fig.8 Effect of pH on the crude cellulase

图9 酶的pH稳定性试验Fig.9 The pH stability of crude cellulase

3 结论

利用耐高温纤维素酶作为生物催化剂的优势在于酶制剂稳定性好，在高温下进行酶解反应能增加纤维素的溶解性和可利用性，因此耐高温纤维素酶生产菌株的选育尤为重要［16］.国内外报道较多产高温纤维素酶的菌株主要有热纤梭菌(Clostridium thermocel)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、尖孢镰刀菌(Fusarium Oxysporum)、链霉菌属(Streptomyces)、曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)等［17－22］.目前土曲霉产高温纤维素酶方面也有一些相关报道，高建民等分离到一株嗜酸性土曲霉，其羧甲基纤维素酶的活力为3.68 U·mL－1，最适反应温度和pH分别为60℃和2.0［23］;Liu dongyang于2011年报道了一株嗜热土曲霉所产的CMC酶的最适反应温度为50℃，最适pH为4.0［24］;谢天文等对产纤维素酶菌株X－13进行了产酶条件优化，其CMC酶活力达到了2.94 U·mL－1［25］.本研究从造纸厂污泥及稻草腐烂秸秆中筛选获得一株产高温纤维素酶的菌株XM5，根据菌株的形态学特征以及ITS序列同源性和系统发育分析结果，将其鉴定为土曲霉(Aspergillus terreus).筛选的土曲霉XM5所产CMC酶和FPA酶的活力分别为4.3和1.39 U·mL－1，具有一定的优势，其最适作用温度均为65℃，CMC酶在80℃下保温2 h活力保持在53.67%;FPA酶在80℃下保温2 h后活力残留41.89%，具有较好的热稳定性;其最适作用pH为4.0，且具有较广的pH稳定范围.因此，在后续研究中，可通过诱变育种、发酵条件优化等对土曲霉XM5展开深入的研究.

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