四湖总干渠环境雌激素不同浓度江段繁殖生物学比较研究

郭嫦娟 廖 涛 柳 明 谢松光

(1.中国科学院水生生物研究所, 中国科学院水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉430072; 2.中国科学院大学,

北京 100049; 3.湖北省环境科学研究院, 武汉 430072; 4.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所, 武汉430064;5.中国科学院水生生物研究所淮安研究中心, 淮安223002)

环境雌激素(Environmental estrogens, EEs)是指干扰生物体内源激素的合成、分泌、运输、结合和代谢等过程的外源性化学物质[1]。我国主要河流水系及沿海地区水体均不同程度受到环境雌激素的污染。多氯联苯(PCBs)、壬基酚、双酚 A、邻苯二甲酸酯类等有机化工原料类一般在南方水体检出率较高, 有机氯农药和生活用水排放是这些环境雌激素的主要来源[2]。环境雌激素对生态环境和人类健康的影响已受到社会的广泛关注。

大量实验室毒性实验证明, 环境雌激素影响鱼类的生长和繁殖[3—5], 这种个体水平的影响可能进一步影响鱼类的种群动态。然而有关自然水体中环境雌激素的生物学效应研究还很少。(Hemiculter Leucisculus)隶属于鲤形目(Cyprinidae)、鲤科(Cyprinidae)、属, 是生活于水体中上层的小型鱼类, 在我国分布广泛[6]。分批产卵, 繁殖季节为4—8月, 5—6月为盛季。本文选择湖北省境内四湖总干渠, 比较环境雌激素不同浓度江段繁殖群体的生物学特征, 为评价环境雌激素对鱼类的影响效应提供自然水体的证据。

1 研究地点

四湖总干渠源于湖北荆州地区, 经潜江、监利、洪湖至新滩口汇入长江, 全长100多km[7]。沿途城镇生活污水、工业废水和农田用水排入总干渠[8]。总干渠中没有鱼类放养和渔业捕捞。

采样在 A、B、C三个河段进行。其中 A段(30°21′49″N/112°30′12″E)离源头较近, 水质良好; B段(30°11′09″N/112°36′09″E)位于一个农药厂排污口下方; C 段(30°03′24″N/112°54′21″E)位于某城镇排污口下方。

2 材料与方法

2.1 主要仪器与试剂

波恩氏液(苦味酸饱和水溶液∶甲醛∶冰醋酸为 15∶5∶1); 肝素钠溶液(用无菌水配成 1 mg/mL的浓度, 4℃保存); 5%甲醛溶液, 无水乙醇, 浓H2SO4(上海国药); 雌激素标准品(Sigma公司); 色谱分析中的乙酸乙酯、甲醇、正己烷为农药级, 乙腈为色谱纯。

电子天平 (0.001 g)(SHIMADZU- BL-320H)、GCMS(Agilent 7890A-5975C); Oasis HLB柱(Waters)、光学显微镜(OLYMPUS BX51)、解剖镜(OLYMPUSSZX16)、轮转式切片机(LEICA -RM2235) 。

2.2 样品采集与处理

采样于2009年6月19日和20日进行, 采用流刺网(长： 17 m, 宽 1 m, 网目： 2.0 cm)采集繁殖群体, 每个采样点采集30尾以上。样品采集后立即置于冰块中保存, 带回实验室后测定标准体长(Standard length, SL, 0.1 mm)、称体重(Body weight,BW, 0.01 g); 将腹部剖开, 观察性腺, 确定性别和性腺发育状况; 选择性腺发育成熟雌鱼, 分离部分卵巢, 称重后固定于5%的福尔马林溶液中, 在解剖镜下测定卵径; 取出肝脏、称重(Liver weight, LW,0.001 g), 肝体指数(HSI)采用以下公式计算：

取部分肝脏和精巢组织, 在波恩氏液中固定12—24h后, 转入70%乙醇溶液中保存, 用于组织切片和观察。切片时依次采用乙醇梯度浓度脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋, 切片, 烘片, 二甲苯脱蜡、系列乙醇复水, 苏木精—伊红染色, 乙醇脱水、二甲苯透明, 中性树胶封片, 在显微镜下观察并拍照。

鱼类采集同时用采水器采集表层水样 3 L, 现场用浓硫酸固定, 采用0.45 μm滤膜过滤, 用浓硫酸将pH调为3左右, 保存于4℃, 48h内进行环境雌激素分析。测定时采用固相萃取方法对样品进行浓缩分离, 采用气相色谱与质谱联用 GC-MS的方法测定水样中环境雌激素浓度[9]。

2.3 数据处理

采用嵌套方差分析(Nested ANOVA)检验不同样点间卵径差异显著性。采用双因子方差分析(Twoway ANOVA)和最小显著差数法(LSD)检验不同样点、性别的HSI的差异显著性。显著性检验的显著水平为P<0.05。统计分析采用 STATISTICA 6.0进行。

3 结果

3.1 不同江段内分泌干扰物浓度

A河段水样中没有检测出环境雌激素, B、C两河段水样中均检测出壬基酚和双酚A两种环境雌激素, B、C两河段间两种污染物浓度均无显著性差异(表 1)。

样点对卵径存在显著的影响(Nested ANOVA,P<0.05), 多重比较表明A样点卵径平均值显著大于B、C样点, B、C样点间卵径平均值差异不显著(表1)。

3.3 肝体指数和肝脏切片

采样点和性别对HSI均存在显著差异(two-way ANOVA)。A样点雌性和雄性个体的HSI均显著低于B、C样点(P<0.05); 三样点中雌性个体的肝体指数均显著高于雄性个体(P<0.05)(表1)。

表1 湖北四湖总干渠不同采样江段(A、B、C)环境雌激素水平和繁殖群体的生物学特征Tab.1 The levels of environmental estrogen in the water and the reproductive characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B and C) in the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

表1 湖北四湖总干渠不同采样江段(A、B、C)环境雌激素水平和繁殖群体的生物学特征Tab.1 The levels of environmental estrogen in the water and the reproductive characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B and C) in the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

注： 同一行中平均数上标小写英文字母不同, 表示差异显著(P<0.05); 同一列中肝体指数平均数上标大写英文字母不同, 表示雌雄个体间差异显著(P<0.05)Note： Means in a row with different superscripts of lower letlers are significantly different from each other (P<0.05); Means of Hepato somatic Index in a column with different superscripts of capital letters are significantly different from each other (P<0.05)

A B C双酚 A(μg/L) Bisphenol A — 7.30±1.91 3.15±1.11环境雌激素水平Environmental estrogen level 壬基酚(μg/L) Nonylphenol — 12.84±3.49 18.12±2.84雌性个体百分比(%) Female percentage 38.02 58.93 61.11卵径(mm) Egg diameter 0.67±0.08a 0.50±0.05b 0.51±0.04b肝体指数(♀) Hepatosomatic Index 1.44±0.94aA 2.56±0.57bA 2.70±0.44bAimages/BZ_324_259_2724_293_2754.png繁殖群体生物学指标Reproductive characteristics肝体指数(♂) Hepatosomatic Index 0.95±0.54aB 1.40±0.58bB 1.68±0.48bB

图1 四湖总干渠不同江段肝脏组织切片显微照片Fig.1 The liver histological pictures of Hemiculter leucisculus from different sections of the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

3.4 精巢切片

4 讨论

四湖总干渠源头A江段水体未检测出环境雌激素, 而B、C两江段主要含有壬基酚和双酚A, 两种污染物总浓度均在20 μg/L左右。与A江段相比, B、C江段繁殖群体中雌性个体的比例明显较高, 卵粒较小; 雄性个体精巢中空增大, 结缔组织坏死或断裂, 精原细胞和精子细胞密度低; 肝体指数增大、肝组织出现大量空泡, 肝细胞密度降低、细胞核不明显等特点。壬基酚和双酚A等一类污染物已经被证明具有显著雌激素活性[10,11]。由于这些环境雌激素化学结构与鱼体内生理合成的雌激素十分相似,可以与体内雌激素受体结合, 影响相关内源雌激素的合成、释放、输送、代谢、结合、作用或消除过程, 进而影响鱼类的早期生长发育、性别分化、繁殖等[12,13]。双酚A对斑马鱼的生殖有明显的抑制作用, 而壬基酚和双酚A具有协同效应甚至中断生殖行为[14]。B、C江段水体中壬基酚和双酚 A浓度较高可能是导致繁殖群体生物学特征改变的重要原因。

水体中的环境雌激素能够影响鱼类性别决定过程, 对鱼类产生明显的雌性化效应, 改变鱼类个体内源激素表达水平, 从而引起种群性比改变。如英国调查报告表明, 生活在工厂排污河流的石斑鱼发生了严重的雌性化现象[15], 在诺福克郡的艾尔河观测点, 接受调查的雄性石斑鱼 60%出现了雌性化的特征, 雌性石斑鱼比例显著高于对照点[16]。在本研究中B、C江段繁殖群体的雌性个体比例较高可能与该江段中壬基酚和双酚A的雌激素效应相关, 与以上文献报道结果一致。

精巢是环境雌激素可以直接产生作用的靶器官。Bjerselius,et al.[17]和Gimeno,et al.[18]分别发现雌激素暴露下的雄性鲫鱼和雄性鲤鱼都会产生精子数量下降, 甚至没有精液的现象。Jobling,et al.发现暴露在壬基酚中的虹鳟雄性生殖腺的生长受抑制[19]。双酚A对断乳期F1雄性子代大鼠生殖和发育有影响, 可能导致生精细胞凋亡增强, 增殖减慢, 细胞内转录、表达受阻[20]。随着环境雌激素浓度的增加,有可能使动物精巢中的一些细胞凋亡或者坏死的速度增加[21]。在本研究中环境雌激素污染物浓度较高的 B、C江段精巢组织结构破坏与以上环境雌激素效应一致。

进入生物体内的壬基酚和双酚A必须通过肝脏的代谢才能排除体外, 在内分泌干扰物的刺激下,混合功能氧化酶等肝脏解毒酶的诱导效应致使肝细胞肿大, 肝脏增大[22]。刘萍发现暴露于壬基酚、双酚A、辛基酚和17β-雌二醇这四种化合物中的金鱼HSI较对照组显著升高[23]。而 B、C点肝脏细胞肿大, 核萎缩变形, 细胞空泡化以及局部肝组织坏死, 与环境雌激素作为外源异生物质在肝中的代谢密切相关。

虽然已经有很多受控实验证明环境雌激素对鱼类繁殖的影响, 但野外原位实验直接证据还较少。本研究显示在自然环境中, 环境雌激素浓度较高的水体, 鱼类繁殖群体的繁殖生物特征显著改变, 可能导致鱼类精子和卵子质量降低、繁殖成功率下降等, 从而影响鱼类种群数量和结构。很多天然水体都受到环境雌激素不同程度的污染, 如我国黄河口表层水体壬基酚平均值为47.5 ng/L[25], 珠江三角洲河段为 0.02—0.165 μg/L[26], 北黄海近岸浓度为15.13—762.73 ng/L[27]。有关环境雌激素污染物对鱼类种群动态的影响需要通过研究环境雌激素污染水体相关鱼类的种群动力学特征进一步阐述。

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