长江口中华绒螯蟹放流亲蟹对环境的生理适应

曹 侦冯广朋庄 平王 慧王瑞芳章龙珍

(1. 中国水产科学研究院东海水产研究所, 农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室, 上海 200090; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 3. 华东师范大学生命科学学院, 上海 200062)

长江口中华绒螯蟹放流亲蟹对环境的生理适应

曹 侦1,2冯广朋1庄 平1,2王 慧1王瑞芳1,3章龙珍1

(1. 中国水产科学研究院东海水产研究所, 农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室, 上海 200090; 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 3. 华东师范大学生命科学学院, 上海 200062)

按回捕日期取样测定长江口中华绒螯蟹亲蟹标志放流前后血清与肝胰腺的生理指标, 初步研究了放流亲蟹对长江口环境的生理适应过程。结果表明, 在放流后6d, 亲蟹肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及血清甘油三酯(TG)和血蓝蛋白含量均降低, SOD、CAT和TG在放流后9d达到较低水平,其中SOD活性和TG含量较放流前显著降低(P<0.05); 肝胰腺酸性磷酸酶(ACP)以及血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白质(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)和肌酐(CREA)水平在放流后总体呈现先升高后降低的趋势; 在放流后79d, 肝胰腺SOD、CAT、ACP与血清ALP、ALT、AST活性均恢复至放流前水平(P>0.05), 而血清TP、血蓝蛋白、ALB、TC、TG、CREA含量较放流前均显著降低(P<0.05)。综合各项指标表明, 中华绒螯蟹亲蟹在放流后6d内出现免疫力下降、代谢增强等反应, 放流22d后亲蟹各项机能逐步恢复, 并在70d后接近或达到放流前水平。建议今后放流前对亲蟹进行环境适应性驯化,以便提高亲蟹增殖放流效果。

中华绒螯蟹; 放流; 肝胰腺; 血清; 代谢

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)在我国分布广泛,北到辽宁, 南至福建, 在沿海各省通海河流中几乎均有分布, 但群体自然分布以长江中下游为主[1]。20世纪70—90年代, 由于过度捕捞、生境破坏等原因,长江口中华绒螯蟹资源急剧衰退[2]。水生动物增殖放流对野生种群破坏后资源的恢复具有重要的意义,也是目前国内外的主要修复措施[3,4]。到目前为止,在长江口放流中华绒螯蟹亲蟹已进行多次, 对资源的恢复起到了重要的作用[5—7]。

标志放流在渔业资源保护和科研中应用广泛,目前主要集中于水生生物的洄游、分布、生长等方面的研究[8—12]。金刚用标志重捕法估算了湖北大治保安湖一围栏湖汊中二龄河蟹的种群数量[10]; 刘永昌通过标志放流研究了渤海对虾的洄游、分布和中心渔场的位置等[12]; 吴祖杰等探讨了浙江沿海标志放流的中国对虾的移动、分布规律及生长、成活和产卵等情况。目前, 有关放流物种对环境适应能力的研究报道主要集中于放流物种的生长状况[13], 而关于放流物种在放流后对环境的生理适应性研究报道较少。本研究以长江口中华绒螯蟹放流亲蟹为对象, 测定了放流前后血清蛋白、脂类、碱性磷酸酶、转氨酶和肌酐水平, 以及肝胰腺中抗氧化酶和酸性磷酸酶的活性, 旨在探讨其放流后对环境的生理适应过程, 为提高中华绒螯蟹的增殖放流效果提供参考依据, 并为其他水生生物的增殖放流效果评估提供理论借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料来源与血清采集

实验用蟹来源于2010年12月长江口(上海宝杨码头)增殖放流的中华绒螯蟹亲蟹。放流亲蟹为人工繁育与养殖的中华绒螯蟹, 共3万只, 雌雄比例为3∶1, 生长环境为露天土池塘, 水草覆盖率在50%以上。其中5000只标志, 标志方法为在亲蟹右边螯足上套上专用套环并在其甲壳背面下方贴上防伪标签。放流亲蟹通过丝网回捕, 网目大小为10 cm, 网高1.5 m。每天回捕放流亲蟹的时间根据当天落潮的时间而定, 落潮将要结束的时候拉起网具。每次拉网的时候记录亲蟹总数、标志蟹数量和水文(水温、盐度、pH等)等数据。对每次回捕到的标志亲蟹均详细记录形态学数据(体重、壳长、壳宽等)并取样,当每次回捕亲蟹的数量小于20只时全部取样, 如多于20只则随机取20只亲蟹样本。

将亲蟹用冰麻醉15—20min后, 取出擦干体表水分, 快速测量其体质量、壳长和壳宽。然后用一次性注射器于蟹第三步足基部血窦处抽取血淋巴2 mL,在4℃、3000 r/min的条件下离心20min, 取上层血清存于Eppendorf离心管中, 存放于−20℃冰箱中,用于各项血液指标的测定。然后在装满碎冰的冰盘上快速解剖亲蟹, 取其肝胰腺存于Eppendorf离心管中, 保存于−80℃冰箱中备用。

为尽量减少长江口复杂环境因素变化对放流亲蟹生理生化等指标的干扰, 实验选取回捕位置相对比较集中(31°12.776′N—31°10.570′N, 121°49.200′E—121°50.800′E)、回捕数量较多的同一区域不同时间内回捕到的标志蟹的样品进行各项指标测定, 共77只(表1), 按回捕日期距放流时间(d)分组, 将放流前的中华绒螯蟹组记为0d。各组蟹的回捕位置、样本量、规格及水文情况(表1)。

1.2 测定指标及其测定方法

用深圳迈瑞MINDRAY BS-200全自动生化分析仪测定血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CREA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的活性或含量。先将欲测的指标定标校准, 然后按照生化分析仪操作说明和配套试剂盒测试流程进行测定, 其中TP、ALB、TC、TG采用终点法, ALP、ALT、AST采用动力学法, CREA采用固定时间法。

血清中血蓝蛋白含量的测定参照Chen, et al.[14],通过UNICO UV-2802S紫外分光光度计测得, 血蓝蛋白含量(mmol/L)=(A×R)/(ε×S×P), 式中: A为分光光度计测得的吸光度值; R为反应液的总体积(µL); ε为消光系数; S为待测样品的体积(µL); P为分光光度计中光穿透长度(cm)。

肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)的活性采用采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定, 严格按照对应试剂盒中的操作流程进行测定。

1.3 统计分析

实验结果均用平均值±标准差(Mean±SE)表示,采用SPSS18.0进行数据处理, 处理时对各指标数据进行方差齐性检验, 若具有方差齐性, 则按照单因素方差分析(ANOVA), LSD检验法进行组间数值多重比较; 若不具有方差齐性, 则按照单因素方差分析(ANOVA), Dunnett’s T3检验法进行组间均值多重比较。P<0.05表示差异显著, P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 抗氧化酶、磷酸酶和转氨酶的变化

中华绒螯蟹亲蟹肝胰腺中SOD和CAT的活性在放流后均呈现先降低后升高的趋势, 且均在放流后9d活性最低, 其中, 肝胰腺中SOD的活性在放流后9d较放流前显著降低(P<0.05)(表2)。放流后70d及79d肝胰腺SOD的活性较放流前显著升高(P< 0.05), 而CAT活性放流前后变化不显著(P>0.05)。

表1 实验用中华绒螯蟹亲蟹Tab. 1 Chinese mitten crab for experiment

放流亲蟹肝胰腺中ACP的活性在放流后出现升高的趋势, 到6d ACP活性较高, 但与放流前相比差异不显著(P>0.05), 而后开始降低(表2)。在放流后13d降到最低并显著低于放流前(P<0.05), 而后又开始升高, 在22d达到放流前水平。放流后70d到79d有下降趋势, 但均与放流前差异不显著(P> 0.05)。

在亲蟹血清中ALT、AST和ALP的活性在放流后的变化趋势总体一致, 在放流后9d均达到最高值且显著高于放流前(P<0.05), 而后开始下降(表3)。放流后79d, 血清中三者活性基本恢复至放流前水平(P>0.05)。

表2 放流后不同时间中华绒螯蟹肝胰腺中抗氧化酶和磷酸酶的活性Tab. 2 The activities of antioxidant enzymes and phosphatase in hepatopancreas of E. sinensis at different times after releasing

表3 放流后不同时间中华绒螯蟹血清中磷酸酶和转氨酶的活性Tab. 3 The activities of phosphatase and transferases in serum of E. sinensis at different times after releasing

2.2 蛋白质、脂类和肌酐的变化

在亲蟹血清中TP的含量呈先升高后降低趋势,在6d达到最大值, 而后下降, 22d以后TP含量显著低于放流前(P<0.05)(表4)。在血清中ALB的含量在放流后总体呈现先升后降的趋势, 放流后13d左右其含量最高, 且与放流前差异显著(P<0.05), 而后下降, 放流后70d左右血清中ALB的含量较放流前显著降低(P<0.05)。血蓝蛋白的含量呈波动性变化,放流后血蓝蛋白出现明显下降(P<0.05), 9d恢复至放流前水平, 13d后血清血蓝蛋白含量趋于稳定并显著低于放流前含量(P<0.05)。

在放流中华绒螯蟹血清中TC的含量大体上也呈现先升后降的趋势, 放流后6d TC含量显著升高(P<0.05), 9d开始下降, 70d以后雄蟹血清中的TC含量较放流前显著降低(P<0.05)(表4)。在血清中TG的含量在放流后开始下降, 放流后9d左右TG含量最低且较0d差异显著(P<0.05), 13d和22d基本恢复至0d的水平(P>0.05), 到70d左右最终趋于稳定,但放流前显著降低(P<0.05)。

在亲蟹血清中CREA含量在放流后呈现波动变化, 放流后13d其含量较放流前显著升高(P<0.05),在70d和79d亲蟹血清中CREA含量均较放流前差异不显著(P>0.05)(表4)。

表4 放流后不同时间中华绒螯蟹血清中蛋白质及代谢产物和肌酐的含量Tab. 4 The activities of protein and metabolic product in serum of E. sinensis at different times after releasing

3 讨论

3.1 中华绒螯蟹亲蟹放流后抗氧化能力变化

SOD和CAT是生物体内的两种抗氧化的主要酶类, 它们可以相互配合清除生物体内的活性氧自由基。SOD可以阻止氧自由基对细胞的损害、修复受损细胞并能通过反应将氧自由基转化成过氧化氢,而CAT可以将同样对机体有害的过氧化氢分解成对生物体无害的水和氧。因此SOD和CAT常被用作判断生物体非特异性免疫的能力的指标[15—17]。

实验发现, 在中华绒螯蟹亲蟹肝胰腺中SOD和CAT活性在放流后的9d内持续降低, 13d后出现升高趋势, 并在22d恢复至放流前水平, 这可能说明中华绒螯蟹亲蟹的非特异性免疫能力在放流后降低,在22d左右恢复至放流前水平。放流后70d和79d亲蟹的SOD和CAT的活性表明放流亲蟹的非特异性免疫能力较放流前恢复并加强。从捕获放流亲蟹位置的水文信息可以得出, 亲蟹SOD和CAT的这种变化应该跟环境, 胁迫有主要关系。

环境胁迫能够促使生物体机体细胞内的线粒体、微粒体以及胞浆的酶系统与非酶系统反应, 产生活性氧和氧自由基, 从而打破生物机体内的活性氧代谢平衡, 使生物体面临活性氧伤害[18]。洪美玲等[19]研究发现中华绒螯蟹受温度胁迫1d后血淋巴中SOD和CAT活力出现不同程度下降; 陈宇锋等[20]研究发现青蟹肝胰腺中SOD活动随盐度胁迫时间的延长出现先降后升趋势; 还有研究发现机体新陈代谢速度加快会使机体自身抗氧化系统受到影响,从而产生大量的活性氧[11]。在实验中中华绒螯蟹亲蟹肝胰腺SOD和CAT活性在放流后出现降低趋势,应该是亲蟹在向咸淡水交汇处洄游过程中受到温度[21,22]、盐度等环境因子的胁迫和蟹体通过加快自身新陈代谢来减少应激共同作用的结果。中华绒螯蟹亲蟹在放流9d后肝胰腺中SOD活性最低, 这与陈宇锋等[20]发现的青蟹经盐度应激3d后肝胰腺中SOD活性最低的结果相似。

3.2 中华绒螯蟹亲蟹放流后血清磷酸酶、氨基转移

酶的变化

ALP和ACP是甲壳动物体内两种重要的磷酸酶, 它们在机体内能够直接参与磷酸基团的转移和代谢, 加速机体内物质的摄取和转运, 并能形成水解酶体系, 破坏和消除入侵机体的异物, 因此对维持虾、蟹类的生存和生长具有重要的意义[23—26]。研究发现中华绒螯蟹亲蟹血清ALP和肝胰腺ACP活性在放流后出现升高, 13d后开始下降, 其中ACP活性在22d基本恢复至放流前水平, 而ALP活性在79d恢复至放流前水平。这可能是由于蟹进入新环境后, 必须通过加速物质的摄取和转运来提高自身的代谢速度, 减缓环境对自身的应激, 而随着蟹对新环境的适应, 蟹血清中ALP和肝胰腺中ACP活性也慢慢下降。在放流后13d, 蟹肝胰腺中的ACP较放流前显著降低, 推测这与ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶有关[24], ACP活性较放流前降低反映此时亲蟹免疫力有所下降, 这跟SOD和CAT活性变化反映出来的机体的抗氧化能力、免疫力下降的结果一致。研究表明中华绒螯蟹放流亲蟹在放流后体内磷酸基团的转移和代谢增强, 破坏和清除入侵异物的能力升高, 而基本恢复至放流前水平可能需要22d左右, 其中亲蟹血清ALP活性要比肝胰腺中ACP活性恢复得慢。

ALT和AST是两种重要的氨基转移酶, 主要存在于肝脏和心肌细胞中, 在血清中浓度较低。当机体肝细胞或某些组织受损害时, 血清中的这两种酶的活性就会升高[27,28]。研究发现中华绒螯蟹亲蟹在放流后血清中ALT和AST活性升高, 9d后两者的活性最高, 放流22d后ALT活性恢复至放流前水平,而AST活性在79d恢复至放流前水平。初步推测这可能是亲蟹由于受到环境应激导致组织受损, 而随着亲蟹不断对环境的适应, 自身受损的组织逐步恢复。本研究表明中华绒螯蟹亲蟹在放流后蟹体肝细胞或其他组织受损, 在放流后9d可能受损最严重, 22d左右亲蟹肝细胞或其他组织逐渐恢复健康状况,蟹体血清中ALT的恢复速度比AST快。

3.3 中华绒螯蟹亲蟹放流后血清蛋白的变化

血蓝蛋白是生物体内的一种多功能蛋白, 不仅具有输氧、储存能量、渗透压调节、蜕皮过程调节、能量储存、金属离子转运等功能[29,30], 而且血蓝蛋白还具有酚氧化酶活性, 具有抗菌功能[31,32]。实验发现中华绒螯蟹血清中血蓝蛋白含量在放流后降低, 9d后有所升高, 13d降低并逐渐趋于稳定。有研究表明, 在较高盐度的环境中血蓝蛋白可以裂解为自由氨基酸来维持血淋巴渗透压平衡[30], 在实验中中华绒螯蟹亲蟹在放流后血蓝蛋白含量降低应该是亲蟹逐渐往咸淡水处洄游的结果。在10℃条件下, 中华绒螯蟹亲蟹进入咸水2—3d后便进入发情阶段[33],血蓝蛋白含量的升高可以满足蟹体活动和交配时对耗氧量的需要[34], 亲蟹在放流后9d血蓝蛋白含量升高, 应该跟亲蟹发情有关。

ALB具有调节血浆胶体渗透压以及运输等功能。实验发现中华绒螯蟹亲蟹血清ALB含量在放流后出现升高, 13d含量最高而后开始下降。初步认为中华绒螯蟹亲蟹血清ALB含量在放流后升高是亲蟹通过自身调节来减少应激反应的结果, 一方面蟹体调节自身血浆胶体渗透压, 另一方面蟹体通过加速物质的摄取和转运来提高自身的代谢速度导致的。而放流70d后ALB含量显著低于放流前水平,具体原因还有待进一步探讨。

血清TP不仅是一种重要的营养物质, 还具有运输、凝血、免疫以及调节血浆胶体渗透压等作用[35],对蟹类的健康、营养、疾病的判断具有重要意义。实验发现中华绒螯蟹亲蟹血清TP含量升高, 而后逐渐下降并在22d后显著低于放流前水平。王顺昌等[34]研究表明, 中华绒螯蟹血清中TP含量受盐度刺激影响较大, 在蟹体刚入咸水时有上升趋势。在本实验中亲蟹在放流后TP含量升高, 推测可能是亲蟹往咸淡水洄游过程中受盐度刺激的结果。亲蟹血清TP含量在放流后13d下降并显著低于放流前水平, 可能是TP大量分解为自由氨基酸参与渗透压调节的结果, 也可能是受到血清中血蓝蛋白和ALB含量降低的影响所致。

3.4 中华绒螯蟹亲蟹放流后血清肌酐与脂类的变化

CREA是酸性肌酸的降解产物, 在机体生理状态正常时一般含量相对恒定, 其含量的升高常被作为排泄器官受损和排泄功能受到破坏的判断依据[36,37]。在甲壳动物中, 主要的排泄器官为触角腺和鳃[37]。本研究发现亲蟹血清CREA含量在放流后6d升高, 22d降低, 到70d左右基本恢复至放流前水平, 表明中华绒螯蟹亲蟹放流后触角腺或鳃可能受损, 亲蟹的排泄功能受阻, 22d后亲蟹受损器官和排泄功能逐步恢复至正常。

血清中TC和TG含量能够反映机体脂类代谢的变化。脂类是中华绒螯蟹标准状况下最主要的能源物质[38], 脂类物质含量的变化常被作为甲壳动物受到胁迫时的一种效应[39]。例如, 对虾在受到胁迫时主要通过脂肪代谢来满足自身的能量需求[40,41]。实验发现中华绒螯蟹亲蟹血清TG含量在放流后呈现先降后升再降的波动变化, TC含量则呈先升后降的变化。分析认为亲蟹血清中TG含量在放流后下降,可能是由于亲蟹放流后通过脂肪分解获取所需的能量来应对环境胁迫(主要是盐度和温度)的结果。有研究发现, 当机体通过脂类提供所需能量时, 脂酶活性和机体内游离脂肪酸含量升高, 血液中TC含量降低[42,43]。在本实验中亲蟹在放流后通过分解脂肪获取能量时, 血清TC含量却出现升高, 具体原因还有待进一步研究。

由于长江口环境的复杂性, 本实验选取回捕位置较集中的放流亲蟹为实验对象, 而且受到回捕亲蟹样本量的限制, 所得结果仅能初步反映长江口中华绒螯蟹放流亲蟹对环境的生理适应状况, 而较大范围全面的生理适应性还需要进行系统试验进一步阐明。

4 结论

本研究发现, 中华绒螯蟹亲蟹在放流后向长江口咸淡水处洄游, 蟹体出现非特异性免疫下降、代谢增强等反应, 在放流后9d亲蟹免疫力最低、物质代谢均受到影响, 放流后22d亲蟹的各项机能逐步恢复, 并均在70d接近或达到放流前水平, 表明此时放流亲蟹基本适应了长江口的环境, 同时也表明放流亲蟹对长江口环境的生理适应可能需要22d,这可为今后长江口中华绒螯蟹亲蟹放流与生理适应评估提供理论参考。为提高增殖放流效果, 建议在放流前对亲蟹进行适宜的营养强化及环境适应性驯化。

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THE PHYSIOLOGY ADAPTION OF THE MATURE ERIOCHEIR SINENSIS TO THE ENVIRONMENT OF THE YANGTZE ESTUARY AFTER STOCKING

CAO Zhen1,2, FENG Guang-Peng1, ZHUANG Ping1,2, WANG Hui1, WANG Rui-Fang1,3, and ZHANG Long-Zhen1
(1. Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation, Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China; 2. College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. College of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200062, China)

This study investigated the physiology adaption of the mature Eriocheir sinensis to the environment of the Yangtze estuary after stocking by tagging method. Thirty thousand mature crabs were released in the Yangtze estuary on December 23, 2010, and five thousand of which were tagged both by the label tag and the ringlike tag. The fishing tools of the recapture were 1.5-meter-high fishing nets, whose mesh size was 10 cm2. The daily fishing time depended on the ebb tide time of the Yangtze estuary, and the fishing mesh was pulled up at the end of the ebb in the daytime. Simultaneously, the data was recorded, which included the number of the crabs and the temperature, the salinity pH and the dissolved oxygen of the water and so on. We tested and recorded some physiological and biochemical indices of the hepatopancreas and the serum of the crabs before and after stocking, which were recaptured in different days. If the crabs’ number of the same day and place more than 20, we selected 20 crabs randomly as the samples to test the indices. However, if the number is less than 20, all the crabs were selected. To reduce the impact to the indices, which was made by the complex environments of Yangtze estuary, the samples of the crabs that were captured in the similar area was selected out and divided into 6 groups according the captured day. And set the samples of the carbs before stocking as the control group. There were 7 groups in the experiment, which were 0d, 6d, 9d, 13d, 22d, 70d, and 79d group. Then compared and analyzed the data with SPSS statistic software. The result showed that the indices had some changes after the crabs being released. After having been released for 6 days, the activities of superoxide dismutase (SOD) and the catalase (CAT) in the hepatopancreas and the concentration of the triglyceride (TG) and the hemocyanin in the serum of the mature crabs were reduced on the 6th day after. And then three days later, the SOD, CAT activities and TG concentration of the mature crabs all declined to a very low level. And at this time, the SOD activity and TG concentration of the mature crabs were significantly different with those before stocking (P<0.05). After stocking, the activity of acid phosphatase (ACP) in the hepatopancreas and the activities (or concentrations) of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), hemocyanin, total protein (TP), albumin (ALB), total cholesterol (TC), creatinine (CREA) in the serum of the mature crabs all increased first and then declined broadly. On the 79th day after stocking, the SOD, CAT, ACP activities in the hepatopancreas and the ALP, ALT, AST activities in the serum of the mature crabs all resumed to a similar level with those before being released (P>0.05). However, the TP, hemocyanin, ALB, TC, TG, CREA activities in the serum were significantly lower than those before stocking (P<0.05). Through the research, we found that the mature Eriocheir sinensis had series of reaction after stocking, such as the immunity declined and the metabolism enhanced. The metabolism and the function of the organs and tissues of the mature crabs were resumed step by step after having been released for 22 days. And they all reached the similar level with those of the crabs before stocking on the 70th day. The result showed that it may take the mature crabs 22 days to adapt the environment of the Yangtze estuary. In order to strengthen the environmental adaptability and the stock enhancement effect of the Eriocheir sinensis, good nutrition diets and related environmental acclimation should be provided.

Eriocheir sinensis; Stocking; Hepatopancreas; Serum; Metabolism

Q142

A

1000-3207(2013)01-0034-08

10.7541/2013.34

2011-12-12;

2012-11-01

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(东海水产研究所2011M08); 国家公益性行业(农业)科研专项(200903048-07);上海市长江口青草沙水库邻近水域生态修复专项资助

曹侦(1986—), 男, 山东泰安人; 硕士研究生; 主要从事河口生态学研究。E-mail: evercz@126.com

庄平, E-mail: pzhuang@online.sh.cn