4种外生菌根真菌吸收氮素营养的特性

张小燕

(重庆师范大学生命科学学院，重庆 401331)

菌根(Mycorrhiza)是真菌与植物的共生联合体，1885年Frank就描述了真菌与植物的这种共生关系并提出了“菌根”这一名词。外生菌根又称菌套菌根，是由外生菌根真菌侵染植物营养根的表面而形成的。外生菌根多形成于木本植物，大多为森林乔木如松科、桦木科、柏科和樟科等。菌根真菌同其他微生物一样有营养要求，现在已经实现了对部分外生菌根真菌的纯培养研究，其生长生理也得到了较详细的研究。早在1894年Frank就提出外生菌根能够吸收利用土壤中的氮［1］。Martin和Botton［2］报道，与外生菌根真菌形成共生体之后，五针松(Pinus strobes)氮、磷、钾养分的吸收量明显增加。迄今为止，人们对外生菌根真菌及外生菌根活化和吸收磷的作用机理及其影响因素已作了大量研究，科研工作者常常把外生菌根促进植物生长的作用归结于它们促进了磷的吸收。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 试验选用彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius715)，1996年从四川西昌的桉树林红壤中分离获得，属于担子菌门、腹菌类、硬马勃目、豆马勃属;松乳菇(Lactarius deliciosus)(2002年10月从重庆市三峡库区天然林采集子实体分离获得，属于担子菌门、伞菌目、红菇科、乳菇属)的3个株系均由西南大学资源环境学院黄建国教授提供。

1.1.2 培养基 Pachlewski培养基(g/L):酒石酸铵0.5，磷酸二氢钾1.0，MgSO4·7H2O 0.5，麦芽糖5，葡萄糖20，维生素B10.1×10－3、琼脂20及1 mL微量元素混合液(每升混合液内含H3BO38.5 mg，MnSO45 mg，FeSO46 mg，CuSO40.625 mg，(NH4)2MoO42.77 mg)。

1.2 方法

1.2.1 生物量 过滤收集获得的菌丝体，用去离子水小心冲洗干净、烘干((80±2)℃，6 h)、称量。

1.2.2 滤液中氮浓度的测定 铵态氮:靛酚蓝比色法;硝态氮:酚二磺酸比色法;谷氨酸态氮:茚三酮比色法。菌丝体含氮量以培养液中初始氮的浓度减去接种真菌后的剩余氮的浓度的差值与其生物量的比值来计算。

1.2.3 数据处理 利用Excel、DPS和SINGMAPLOT的统计工具对试验数据进行统计作图分析，显著水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 外生菌根真菌的氮营养吸收特性

2.1.1 不同氮源对外生菌根真菌生长的影响培养液中营养元素的不同形态对外生菌根真菌纯培养的影响，因菌种的不同而异，有的在无机营养中生长较快，而有的在有机营养中长势较好。由图1可见，外生菌根真菌的生长量因培养液中的氮源和菌种的种类不同而不同。彩色豆马勃Pt 715和松乳菇Ld-3在3种氮源上的生物量无显著差异，变化于101.7～146.3 mg/bottle之间，表现出对3种氮源无偏好性;Ld-1在NO3－-N上的长势明显好于在 NH4+-N和Glu-N，并且在 NO3－-N上的生物量是其在NH4+-N和 Glu-N上的两倍多;而 Ld-2在NO3－-N和Glu-N上均生长的较好，显著强于含NH4+-N的培养液。

图1 不同氮源对外生菌根真菌生长的影响Fig.1 Effect of nitrogen source on the growth of ectomycorrhizal fungi

2.1.2 不同氮源对外生菌根真菌菌丝含氮量的影响 图2是在不同氮源条件下，外生菌根真菌的菌丝体含氮量。

图2 不同氮源对外生菌根真菌含氮量的影响Fig.2 Effect of nitrogen source on the nitrogen conceration by ectomycorrhizal fungi

2.1.3 不同氮源对外生菌根真菌吸氮量的影响

吸氮量是菌丝的生物量和含氮量的乘积，结果表明Pt 715、Ld-1和Ld-3对3种氮源的吸收量顺序都为对的吸收最好，要显著高于和Glu-N(图3)。总的来说，Ld-2和Ld-3对3种氮素的吸收要好于Ld-1，Ld-1对的吸收最好为5.591 6 mg/bottle而对Glu-N的吸收只有2.094 8 mg/bottle，是供试菌株中吸氮量最少的;Ld-2对的吸收比对和Glu-N增加14.2%，其对和Glu-N的吸收利用无显著差异;Ld-3菌丝体吸氮范围变化于6.548 3～7.718 3 mg/bottle之间，其中对的吸收最好。根据本实验结果Pt 715比较适合于在上生长，其对的吸收利用效率最高为7.784 6 mg/bottle，这与前人的研究结果是一致的。

图3 不同氮源对外生菌根真菌吸氮量的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on the nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungi

2.2 外生菌根真菌吸收氮的动力学研究

如前所述，高等植物和外生菌根真菌吸收养分符合Michaelis-Menten酶动力学方程。本实验对松乳菇的3个株系进行了动力学研究，建立了相关的动力学曲线(图4、5、6)。

图4 外生菌根真菌Ld-1的氮素吸附动力图Fig.4 Kinetic curve of nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungus Ld-1

图5 外生菌根真菌Ld-2的氮素吸附动力图Fig.5 Kinetic curve of nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungus Ld-2

图6 外生菌根真菌Ld-3的氮素吸附动力图Fig.6 Kinetic curve of nitrogen absorption by ectomycorrhizal fungus Ld-3

根据以上动力学曲线以及相应的动力学方程可以得出动力学常数(Imax、Km和Cmin)(表1)。

表1 外生菌根真菌吸收氮的动力学常数(mmol/L)Table1 Kinetic parameters of nitrogen nitrition+absorption by ectomycorrhizal fungi

实验结果表明，不同外生菌根真菌吸收氮素的动力学参数差异很大(表1)。对NH4+-N来说，3个菌株的Km值变化范围在21.88～24.80 μmol/L之间，其中Ld-2最大，Ld-3最小，表明不同外生菌根真菌吸氮位点与的亲和力不同，Ld-3吸氮位点与的亲和力最好，Ld-2吸氮位点与的亲和力最差;Imax为85.73～122.86 μmol/(g·dw)/h，Ld-3最大，Ld-2和Ld-1间无显著差异，即外生菌根真菌Ld-3对的吸收速率最大;Cmin为0.52～0.55 μmol/L，3个菌株间无显著差异，即菌株从外界吸收的最低浓度相似。

统计分析表明，Ld-3对2种氮源的Km和Cmin值最小，此菌株能适应低养分的土壤环境，并且是松乳菇株系中一种高效的吸收NH4+-N和Glu-N的菌株。

3 讨论

3.1 外生菌根真菌的氮营养吸收特征

试验发现供试4种外生菌根真菌在3种形态的氮素培养基上生长良好，培养2～3周后其生物量都在100 mg以上，最高可达349.6 mg，说明供试菌株对氮素营养的适应性很强。但是，外生菌根真菌在不同的氮源上生长因菌种的不同而有差异，Ld-1在培养基上生长势最好;Ld-2在和Glu-N上生长较好;Pt 715和Ld-3对3种氮源的培养基上无显著差异，对Pt 715的研究结果与Smith R.A的报道一致［3-4］。

供试菌株均能很好地吸收3种氮源，其中Pt 715的优势氮源为和Ld-3的优势氮源为。但它们吸收利用氮素营养的机理尚不清楚，在氮素利用的过程中，有关酶类(硝酸还原酶、磷酸酶和脲酶等)起重要作用，尚需深入研究。

随着社会经济的发展，以及对化学肥料存在的环境危害性的认识等原因，生物肥料正在日益受到重视。国内外已经有很多科研人员开发出菌肥产品，菌根菌剂的研究也正为人们所熟悉。因此本试验研究结果还为菌根菌剂的生产提供充分的理论依据，为以获得营养体为目的的外生菌根真菌培养体系的建立打下了基础。

3.2 外生菌根真菌的氮营养吸收机理探讨

研究表明，高等植物和外生菌根真菌吸收养分符合Michaelis-Menten酶动力学方程，研究外生菌根真菌吸收氮营养的动力学可以了解外生菌根吸收氮的效率，并探索它们高效吸收氮营养的机理，指示它们适宜生长的土壤条件，并筛选出高效吸收养分的菌根真菌的株系。

土壤中氮素的形态和含量受自然因素(气候、环境、地形及植被)和农业措施(耕作、施肥、灌溉及利用方式)的影响，变异性很大。土壤中的氮素大多数以有机氮的形态存在，无机氮仅占土壤总氮的1%，而被植物吸收利用的主要是无机氮(铵态氮和硝态氮)。不同性质的土壤中无机态氮的含量也有很大的差异，如酸性土壤含量要多一些，而碱性土壤中含量要多一些［5］。在我国西部地区很多荒山荒地需要通过植被来恢复，但这些地区的营养元素非常贫瘠。因此对外生菌根真菌吸附氮素的动力学进行探讨研究有利于推动菌根技术的广泛应用，从而因地制宜地选择优良的菌种进行植树造林，造福人类，美化环境。

本试验供试菌株对外界环境中的氮素吸附的最小浓度在0.52～0.82 μg/L之间，这要远远小于土壤中氮的浓度，因此供试外生菌根真菌在极其贫瘠的土壤中都能有效地吸收氮。统计分析表明，Ld-3对和Glu-N 2种氮源的Km和Cmin值最小，此菌株能适应低养分的土壤环境，是松乳菇株系中一种高效吸氮的菌株可将之应用到相应的低养分土壤中。但是由于某些外生菌根真菌在共生状态下和离体培养时其生物学特性存在很大的差异，所以对共生状态下的特性状况有待于进一步研究探讨。

植物根系养分吸收的动力学研究在植物的矿质营养中占有重要地位，早在20世纪50年代初期Epstein和Hagen［6］就开始研究根对离子的吸收动力学。根系养分吸收动力学研究为阐明养分吸收特性、鉴定和筛选养分高效吸收的基因型提供了有利的手段，但是动力学参数并非恒定的参数，对于既定的养分离子来说它随植物种类不同、品种不同、苗龄不同、营养状态的不同而发生变化。至今，小麦、大麦、玉米、豆科植物、水稻等对N、P、K、Ca、Mg等的吸收动力学已得到深入研究，而对森林乔木的研究少有报道［7-12］。根据现有的研究报道，养分供应状态也会影响植物根系吸收动力学的参数，据 Drew［10］报道，缺P培养4 d或更多天可使大麦的Imax值增加4倍，而Km值不变。外生菌根真菌能促进寄主植物对养分元素的吸收，因此可以推测菌根的形成也会影响寄主的动力学参数，但具体菌根真菌对其寄主的动力学参数的影响是正面影响还是负面影响有待于进一步对菌根共生体进行研究探讨。

4 结论

供试菌株均能较好地吸收上述3种氮源，其中Pisolithus tinctorius715的优势氮源为Lactarius delicious-1、Lactarius delicious-2和Lactari-us delicious-3的优势氮源为

Lactarius delicious3个株系吸收氮的动力学参数Cmin(菌根真菌净吸收大于零时的外界溶液中养分元素的浓度)在0.52～0.82 μmol/L 之间，远远小于土壤溶液中氮的浓度，表明供试外生菌根真菌在极其贫瘠的土壤中仍能有效地吸收氮素，有益于树木对痕量氮的利用。此外，不同外生菌根真菌氮素的吸收位点和氮的亲和力不同，吸收氮的能力也不一样，说明在不同生态条件下，可能存在不同的高效吸收氮素的优良外生菌根真菌。

Lactarius delicious-3吸收和Glu-N的Km和Cmin值最小，能适应低养分的土壤环境，是供试松乳菇株系中吸收和Glu-N效率最高的菌株，在贫瘠土壤上植树造林可能有一定的应用前景。

［1］陈文新.土壤与环境微生物［M］.北京:北京农业大学出版社，1990.

［2］Martin F.，B.Botton.Nitrogen metabolism of ectomycorrhizal fungi and ectomycorrhiza［J］.Advances in Plant Pathology，1993，9:83-102.

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