无呼吸机支持下小鼠主动脉弓缩窄模型优化法评价

张焕基，黄 辉，张 坤，刘 宇，黄菲菲，王景峰

(1.中山大学孙逸仙纪念医院心内科，广州 510120;2.深圳市第四人民医院心内科 深圳 510083)

主动脉弓缩窄(Transverse aortic constriction，TAC)致左室肥厚模型是一种较为常用的研究左室肥厚病理生理过程的动物模型，其广泛用于对动物进行心血管相关药物、分子生物学研究。近年来，基因敲除动物技术的兴起使得借助小鼠进行心血管疾病研究成为一种新的趋势，但用小鼠建立该模型具有一定难度［1］。一方面建立该模型需要显微外科手术，小鼠血管细小且位置较深，容易引起出血、气胸死亡;另一方面目前国内外现有的报道大部分采用气管插管后呼吸机辅助呼吸，由于小鼠气管纤细，气管插管术容易造成气道损伤死亡及呼吸机相关并发症，增加操作难度及死亡率［2-4］。目前国外少数学者开始采用无呼吸机模型下行TAC操作，在熟悉掌握麻醉深度下手术方法较传统方法更为便捷，但国内尚未见有报道。本研究对C57BL/6小鼠建立主动脉弓缩窄压力超负荷左室肥厚模型进行优化，采用免气管插管无呼吸机支持模式，对比有无呼吸机支持下的两种手术方法的1周存活率。术后4周进行心脏超声了解心脏形态及功能的变化，判断模型的建立成功与否，为今后该模型的应用研究提供更为便捷的方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物的选择与分组

分别选择SPF级成年近交系C57BL/6小鼠90只，雄性，体重20～30 g，由中山大学实验动物中心提供【生产许可证号 SCXK(粤)2011-0029】。小鼠随机分3组，为假手术组，无呼吸机手术组，呼吸机手术组，每组各30只。所有动物实验操作程序均经过实验动物管理委员会批准。

1.2 主要仪器

显微手术器械(上海医疗器械有限公司)，OLYMPUS SZ61外科双目手术显微镜(上海精密光学仪器公司，日本)，小动物 ALC-V8S型呼吸机(上海奥尔科特生物科技公司)，LG-PS2鹅颈冷光源(Olympus公司，日本)，VEVO 2100超声仪(Visual Sonics公司，加拿大)。

1.3 小鼠主动脉弓缩窄模型的建立

采用混合麻醉药腹腔注射法。麻醉药品为氯胺酮(8 mg/100 g)+甲苯噻嗪(1.2 mg/100 g)混合液［5］。给药几分钟后小鼠全身松弛，用镊子钳夹指端有反应，表明已达到适宜的麻醉效果。有呼吸机组应用静脉套管针外鞘作为气管插管，头端塑形稍微弯曲，插入深度约25 mm左右。气管插管与呼吸机接头可采用注射器头端及软橡胶管与“Y”形管相连制备而成。颈部用鹅颈灯光源照明，用无齿镊将舌轻柔牵至口腔外一侧，稍微上提舌部暴露声门，声门为一亮点，随呼吸闭合。气管插管时如小鼠呼吸节律发生变化则提示插管成功。接呼吸机控制呼吸(频率100～120次/分，潮气量0.2～0.4 mL)，可见胸廓跟随呼吸机频率规整运动。假手术组、无呼吸机手术组则不需要这一步骤，直接进入下一步开胸操作。开始显微镜无菌操作下分离胸前正中切口皮肤，右手持组织剪沿胸骨正中线自胸骨上缘劈开胸骨至第二肋间，可见胸腺位于胸骨后方视野正中，用自制拉钩牵引胸骨形成4～6 mm宽切口。用无齿组织镊分离胸腺暴露主动脉弓，用组织镊夹5.0线沿气管处主动脉上缘进入后壁及下缘穿出。预先打两个松结，垫扎针0.5 mm直径大小，置于第一结中，打结后抽出垫扎针［6］。缩窄后可见主动脉弓近心端搏动增强。假手术组不进行分离主动脉弓结扎操作。缝合胸部皮下肌肉组织及皮肤，术口用双氧水消毒。

1.4 小鼠超声评价模型

应用VEVO 2100超声仪及24～30MHz高频探头于术前1天，术后4周对小鼠行经胸超声检查。于胸骨旁左心室乳头肌水平短轴切面采集左心室二维图像，同时在该切面下获得左室前后壁M型超声心动图像，记录超过10个心动周期以上。

1.5 统计学分析

应用SPSS16.0统计软件包进行数据处理。文中计量数据用均数±标准差()表示，两组间比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析;计数资料用率表示，组间比较用 Chi-Square分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TAC模型的存活率及并发症

在实验观察中，发现主动脉弓缩窄术中及术后1周内导致小鼠死亡主要原因为主动脉弓破裂、喉头水肿窒息、心房及大血管损伤、胸膜破裂呼吸衰竭等。假手术组中无1例死亡。无呼吸机组中，术中内死亡率13.3%(4/30)，术后1周无1例死亡，术后1周总存活率为86.7%(26/30)。呼吸机组中，术中死亡率为30%(9/30)，术后1周总死亡率为36.7%(11/30)，术后1周存活率为63.3%(19/30)。无呼吸机组术中死亡原因为，主动脉破裂(1只)，胸膜损伤呼吸衰竭(3只)。呼吸机组术中死亡原因为主动脉破裂(1只)、胸膜损伤呼吸衰竭(2只)、心房破裂(1只)、胸壁周围血管损伤(1只)、气道损伤窒息(4只)、术后1周死亡原因为气道水肿窒息(1只)，伤口感染(1只)。无呼吸机组比呼吸机组总存活率明显提高，两组差异有统计学差异(P＜0.05)。

表1 三组小鼠存活率对比Tab.1 The survival rate of mice in three groups

图1 无呼吸机手术组对比假手术组左室前后壁明显增厚Fig.1 Thickness of left ventricular anterior and posterior wall in TAC without ventilator group

表2 小鼠术后4周心脏彩超数据变化Tab.2 Changes of cardiac ultrasonic data after operation in sham and TAC without ventilator groups

2.2 心脏超声对TAC模型的评价

采用心脏超声仪对小鼠进行心脏结构及功能的评价。无呼吸机组和呼吸机组均能使左室壁增厚，左室重量增加及心腔增大。表2数据表明无呼吸机组术后4周，小鼠的左室前壁、后壁在舒张末期及收缩末期均明显增厚(图1)，左室内径在舒张末期增大，差异有统计学意义(P＜0.05);心脏超声仪检测小鼠的左室重量TAC组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。而左室射血分数两组无明显差异(P＞0.05)。

3 讨论

主动脉弓缩窄致心肌肥厚模型是一种理想的模拟人类压力超负荷诱导心肌肥厚病理生理过程的动物模型，其具有模型成功率高、可重复性好、心肌肥厚形成时间短等特点，是目前应用最广泛的构建心肌肥厚模型的方法。由于C57BL/6小鼠的个体体积小，耐受手术能力差，而且手术需要在显微镜下操作，对手术器械要求较高。另外目前采用的方法常见为呼吸机支持下操作，增加了手术难度，并且产生呼吸机相关并发症，增加死亡率。因此该方法手术难度大，学习时间很长，初学者一般需要半年以上才能熟练掌握操作。

针对小鼠TAC模型构建的困难及不足，本实验对现有方法进行了优化，采用无呼吸机辅助呼吸模式，简化了操作步骤，明显减少学习时间，使该技术更为易学。在无呼吸机支持下，麻醉药的剂量控制比较重要，麻醉深度以小鼠反应减弱，但是强刺激肢端有反应为宜，这样不会导致麻醉过度死亡，而且术后恢复快，没有发现麻醉低温现象，在缩短手术时间的基础上，也不需要术中增加麻醉剂量。本研究发现无呼吸机模式下的最大优势在于减少了气道相关的严重并发症，如气管插管导致的喉头水肿窒息，而且术后恢复快，术后1周死亡率低。在呼吸机支持下，胸廓上部受呼吸机频率的作用在显微镜下有较大的振幅，对显微手术的精准定位操作有较大的影响，容易误伤主动脉，或刺破胸膜，增加手术风险及难度。我们发现即使在呼吸机支持下，一旦破坏胸膜的完整性，小鼠出现不规律呼吸后，甚难抢救成功。经过优化后，本实验室后续学习该操作者仅需2～4周便能熟练掌握。

尽管如此，对该模型进行实验时发现，小鼠1周围手术期死亡率较高，约13%，死亡率低于相关文献报道［7］。主要原因为小鼠进行显微外科操作难度较大，主要有易损伤大血管及周围组织导致手术中即刻发生大出血死亡，常见位置为开胸时损伤肋间动脉，缝针误伤锁骨下大静脉，拨开胸腺时心房刺破;开胸时损伤胸膜导致气胸死亡更为常见;难以弓下过结扎线导致镊子扯拉主动脉弓导致破裂，或结扎线过紧导致垫扎针用力拉出撕破主动脉弓。因此为提高手术成功率，避免上述情况发生，术中的操作需注意以下几点:1)开胸时组织剪要对准胸骨正中，尽量一刀到位，避免损伤肋间动脉。胸廓扩张时避免用锐利镊子拨开组织，容易刺破胸膜，胸膜刺破时小鼠表现为突然呼吸深大或点头样呼吸，立即关闭胸腔有时或可挽救成功。2)寻找主动脉弓时分离周围组织手法要细致，胸腺组织不要钳夹，最好钝性分离往腹侧推压，看到搏动的主动脉弓即可，避免使视野模糊导致容易损伤周围血管组织。3)在丝线穿过主动脉弓时，容易过分牵拉主动脉弓导致破裂，我们采用自制打磨后的显微镊子，调整头端弯曲度及锐利度，这样过线时能够很好的保持主动脉弓的原位及顺利刺破弓下组织而不损伤主动脉弓。4)进行主动脉弓结扎时，结扎不易过紧，应松紧适度，以能顺利抽出垫扎针为宜，避免垫扎针抽出时撕破主动脉弓。

早期判断是否成功建立主动脉弓缩窄模型，可通过颈总动脉血流速度检测，对比双侧颈总动脉的差异。由于主动脉弓缩窄后，右侧颈总动脉承担部分血液分流，术中即时表现为搏动增强，术后1周行颈总动脉彩超提示右侧血流速度明显增快。后期动脉模型的评价的关键在于确立心肌肥厚的时间，一般2～4周即可出现肥厚。缩窄越重，出现肥厚的时间越短，但是可能造成小鼠代偿不足，出现心力衰竭死亡［8］。

本阶段研究建立并优化了TAC压力超负荷心肌肥厚模型，优化后的无呼吸机支持下模型构建方法可以简化操作步骤，提高小鼠术后1周内的存活率，小鼠术后恢复快，缩短手术时间和学习时间。对小鼠TAC术后4周进行心脏超声检测提示模型构建成功。本研究为单一中心小样本实验，研究结果可能受术者手术操作熟练度的影响，该方法的实用性仍需进一步探讨，可供同行借鉴参考。

［1］Tarnavski O，Mcmullen J R，Schinke M，et al.Mouse cardiac surgery:comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies［J］.Physiol Genomics.2004，16(3):349-360.

［2］党海舟，李明凯，徐明，等.主动脉弓缩窄术和腹腔注射 IPH致小鼠慢性心衰两种模型的比较和评价［J］.心脏杂志.2012(2).

［3］赵静，曾智，颜亮，等.小动物超声仪与临床用超声仪评价小鼠心脏重构的对比分析［J］.南方医科大学学报.2011(3).

［4］Meng R，Pei Z，Zhang A，et al.AMPK activation enhances PPARalpha activity to inhibit cardiac hypertrophy via ERK1/2 MAPK signaling pathway［J］.Arch Biochem Biophys.2011，511(1-2):1-7.

［5］Wang D，Oparil S，Feng J A，et al.Effects of pressure overload on extracellular matrix expression in the heart of the atrial natriuretic peptide-null mouse［J］.Hypertension.2003，42(1):88-95.

［6］Dealmeida A C，van Oort R J，Wehrens X H.Transverse aortic constriction in mice［J］.J Vis Exp.2010(38).

［7］李晓梅，马依彤，杨毅宁，等.不同品系小鼠主动脉弓缩窄压力负荷模型的比较［J］.实验动物与比较医学.2008(4).

［8］Gao X M，Kiriazis H，Moore X L，et al.Regression of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy in mice［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2005，288(6):H2702-H2707.