扶正抗癌方对小鼠肝癌细胞转移影响的实验研究＊

方 瑜 杨柳青 陈光伟 陕西中医学院（咸阳712046）

原发性肝癌是临床上最常见消化系统的恶性肿瘤之一，其起病较隐匿，进展迅速，恶性程度高，容易复发转移，生存期较短，并有“癌中之王”之称。近年来，在世界范围内，其发病率呈上升趋势［1］。根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。死亡率居第3 位［2］，我国是世界上肝癌的高发地区之一，目前我国发病人数约占全球肝癌病人的50%以上［3］，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。本实验欲通过研究扶正抗癌方中VEGF和nm23在动物模型中的表达来探讨其抗肝癌细胞生长和转移的可能机制。

1 材 料

1.1 瘤 株 H22腹水型肝癌瘤株，第四军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK（军2011－007）。

1.2 实验动物 健康雌性KM 小鼠共85 只，1～1.5 月龄，体重18～22g，动物合格证号：SCXK（陕2011－003）。

1.3 实验用药 扶正抗癌方（FZKAF）由陕中附院制剂研究中心提供（由黄芪、灵芝、女贞子、莪术、山豆根、藤梨根各15g，白术、丹参、法半夏各12g为基础方随证加减），按成人体重60kg计算，20g小鼠每公斤体重生药量折算为126g÷60kg×9.01×0.02kg＝0.378g，将FZKAF 配置成1.89g／mL 混悬液。对照药替加氟（生产批号：20110305，50mg／片）研磨，按成人用量加蒸馏水配制成15mg／mL的混悬液。

1.4 主要试剂 北京博奥森生物工程有限公司生产的兔抗鼠VEGF 单克隆抗体（bs－1313R，0.2mL）；DAB 显色剂（C－0003）；兔抗小鼠nm23 单克隆抗体（bs－0688R，0.1mL）；SP 免疫组化试剂盒（SP－9002；北京中杉金桥生物技术有限公司）。

2 方 法

2.1 操作方法 抽取接种7d的小鼠腹水，染色后计算活肿瘤细胞数并用生理盐水稀释成1×107／mL 的瘤细胞悬液。将瘤细胞悬液按0.25mL／只在小鼠右腋皮下接种造模。取15只健康小鼠作为A：空白对照组；再将造模成功的60只，分别分为B：荷瘤对照组；C：替加氟组；D：扶正抗癌方组；E 组：扶正抗癌方组＋替加氟组。A 组：0.9%生理盐水，0.2mL／只／d灌胃；B组：0.9%生理盐水，0.2mL／只／d灌胃；C 组：15mg／mL 替加氟稀释液，0.2mL／只／d 灌胃；D 组：1.89g／mL 中药煎剂，0.2mL／只／d灌胃；连续14d用药。E 组：浓度为3.78g／mL 中药煎剂0.1mL，浓度为30mg／mL 替加氟溶液0.1mL／只，第1d、第7d采用两药共同灌胃，其他时间采用D 组用药方法，用药14d。小鼠于用药后第15d脱臼处死。

2.2 计算胸腺、脾脏指数测瘤重 摘除小鼠胸腺、脾脏，称重；剥离瘤体称重，固定于10%的甲醛中。脏器指数和抑瘤率计算公式如下：脏器指数＝脏器的重量mg／小鼠的体重g。

2.3 免疫组化法测定VEGF 和nm23的表达 将肿瘤组织按免疫组化SP法常规进行检测。VEGF 和nm23阳性表达为棕黄色，VEGF主要表达于肝癌细胞质，nm23主要表达于癌旁肝细胞。用400倍光学显微镜观察，每例随机观察5个视野，选择不少于100个细胞为准，计算阳性细胞数。阳性表达率＝表达阳性细胞数／总细胞数×100%。

3 结 果

3.1 各组药物对荷瘤小鼠免疫功能的影响 见表1。

表1 各组药物对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响

3.2 各组小鼠癌组织中VEGF 和nm23的表达情况及瘤重比较 见表2。

表2 各组药物对H22荷瘤小鼠肝癌组织中VEGF和nm23的表达情况及瘤重比较

4 讨 论

肿瘤的生长和转移首先依赖于血管的生成，VEGF 能特异地作用于血管内皮细胞，促进血管分裂增殖及新生血管的形成，并能增强血管通透性［4］，支持和促进肿瘤的生长及转移。若没有血管生成肿瘤直径不会超过1mm，并将会坏死、凋亡，更不会发生转移［5］，正常人体没有或仅有很低水平的VEGF 表达，而大多数肿瘤均高度表达以支持其生长及转移。研究证实肿瘤血管形成是HCC 侵袭转移的关键。在98例原发性肝癌患者和40例健康志愿者的血清中发现，原发性肝癌患者血清VEGF水平显著高于正常对照组（P＜0.01），患者血清VEGF的表达水平与患者与肿瘤的组织学分级、浸润深度、转移密切相关（P＜0.01）。证实VEGF与原发性肝癌的转移和浸润有密切相关性［6］。本实验结果显示，VEGF 在荷瘤组小鼠肝癌组织中明显高表达，在用药组表达均降低（P＜0.05），说明用药物可以降低VEGF在肝癌组织中的表达，其中联合用药组最为明显（P＜0.01）。nm23基因是一种抑癌基因，研究发现nm23的表达与肿瘤的转移有着密切的联系［7］，其作用机理如下：①通过催化GTP→GDP的转化参与微蛋白的聚合与解体，改变细胞的黏附运动能力。②通过调节GDP合成参与G 蛋白调控的跨膜信息传递，从而对细胞的分化和癌基因的转化起作用。nm23基因的表达水平与肿瘤细胞的转移呈负相关［8］。罗洪英等［9］研究的结果显示，nm23蛋白的表达强度与肝癌的分化有明显的相关性，肝癌分化程度越低，其nm23蛋白的表达越弱，有转移组的nm23蛋白表达水平显著低于无转移组，本实验显示，在小鼠癌旁组织中，荷瘤组nm23蛋白表达降低，用药组nm23的表达均升高（P＜0.05），说明用药物可以提高抑癌基因nm23的表达，其中以联合用药组最为明显（P＜0.01）。本试验显示二指标不具有相关性，可能的机制为：VEGF 高表达是肿瘤发生发展的早期基因改变，是肿瘤进入血管期后发生浸润、转移的限速步骤［10］，而nm23－H1表达下降是肿瘤发展的后期基因改变，二者在时间上有差异性。在肿瘤晚期VEGF表达的升高和nm23－H1表达的降低可能共同促进了肿瘤的转移。

用药组都有抗肿瘤生长的作用（P＜0.01），其中扶正抗癌方能够提高机体免疫功能，激发机体抗肿瘤免疫效应，遏止肿瘤的生长、播散，够改善小鼠的一般状况、提高小鼠的生活质量；而替加氟在杀伤肿瘤细胞的同时，小鼠体重下降，活动能力差，免疫功能损伤明显。联合用药组在抑瘤率和VEGF、nm23的表达方面优于单纯用药组，说明在化疗过程中同时使用抗癌中药具有减毒增效的作用。肝癌的发病是由正气亏虚，邪毒乘虚而入，肝脏气机失调，气滞血瘀，痰湿内盛，各种病理产物相互积聚于肝脏而成。其形成之后，又进一步耗伤气血，日久因病致虚，使正气更虚，而癌症本身“邪气”较盛，正虚不胜邪而致癌瘤在体内恶化、扩散、转移。扶正抗癌方是正是针对肝癌病机，以“扶正祛邪”为总则，通过本次实验说明该中药抗肝癌的机理可能与降低VEGF和提高nm23的表达抑制肿瘤的生长转移及提高小鼠免疫功能有关。

［1］ Sherman M.Hepatocellular carcinoma：epidemiology，surveillance，and diagnosis［J］.Semin Liver Dis，2010，30（1）：3－16.

［2］ Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Estimating the world cancer burden：Globocan 2002 ［J］.CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74－75.

［3］ 钦伦秀，孙惠川，汤钊猷.原发性肝癌研究进展2006沪港国际肝病大会纪要［J］.中华外科杂志，2006，44（15）：1070－1074.

［4］ Connolly DT，Heuvelman，Nesion R，et al.Tumor vascular permeability factor stimulates endothelial cell growth and angio genesis［J］.J Clin Inves，1989，84（5）：1470.

［5］ Olmgren L O，Rilly MS，Folkmen J.Dormancy of micrometastasis Balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression［J］.Nat Mec 1995，1（2）：149－153.

［6］ 孙屹峰，张超贤，秦咏梅.原发性肝癌患者血清VEGF、TGF－β1表达水平与浸润转移关系的研究［J］.临床肝胆病杂志，2010，26（2）：205－207.

［7］ Boix L，Bruix J，Campo E，et al.nm23－H1expression and disease recurrence after surgical resection of small hepatocellular carcinoma［J］.Gastroen－terology，1994，107：486－491.

［8］ 刘志荣，杨 湛.nm23－H1与肿瘤侵袭、转移的研究进展［J］.现代肿瘤医学，2006，14（9）：1166－1168.

［9］ 罗洪英，王海成，冯德云，等.肝细胞癌组织中PCNA和NM23的表达与转移的关系［J］.湖南医科大学学报，2003，28（1）：17.

［10］ Volpert OV，Dameron KM，Bouck N.Seguential development of an angiogenic phenotype by human fibroblast progressing to tumorigenicity［J］.Oncogene 1997，14（12）：1495－1502.