克拉维酸钾中有关物质G的化学合成与结构鉴定

陈 仿,靳孝庆,曹广祥,张晓晓,王珊珊,钟传青

(1.鲁南制药集团科研部,山东临沂276000;2.山东建筑大学市政与环境工程学院,山东济南250101)

克拉维酸钾中有关物质G的化学合成与结构鉴定

陈 仿1,靳孝庆1,曹广祥1,张晓晓1,王珊珊2,钟传青2

(1.鲁南制药集团科研部,山东临沂276000;2.山东建筑大学市政与环境工程学院,山东济南250101)

以L-酪氨酸和琥珀酸酐为原料、氯化锂为催化剂、冰醋酸为反应溶剂合成了药品克拉维酸钾中的有关物质G。研究了反应溶剂的种类、反应物料配比、反应温度、反应时间等因素对有关物质G收率及纯度的影响,在L-酪氨酸和琥珀酸酐的摩尔比为1∶1.5、95℃加热反应1.0 h的优化条件下,有关物质G粗品的最高纯度达到87.4%,收率为85. 7%。通过制备液相色谱对粗品进行纯化,有关物质G的纯度达到99.6%,总收率为68.6%。采用LC-MS/MS对所合成物质进行了结构鉴定,确定其为欧洲药典中克拉维酸钾的有关物质G。

克拉维酸;有关物质G;化学合成;结构鉴定

克拉维酸(Clavulanic acid)是一种不可逆性竞争型β-内酰胺酶抑制剂,可与β-内酰胺酶的丝氨酸活性位点不可逆结合,从而保护β-内酰胺类抗生素的活性[1,2]。随着细菌耐药性的不断增强,克拉维酸在临床上的应用越来越广泛,最成功的例子就是葛兰素公司的Augmentin(克拉维酸钾与阿莫西林的复合制剂)[3,4]。克拉维酸钾一般采用发酵法生产,生产过程中始终存在N-琥珀酰酪氨酸(结构式见图1),在欧洲药典中标识为有关物质G,并且不容易在提取过程中去除[5]。随着人们对药品质量的要求越来越高,有关物质G因为对药品质量影响很大,其含量要求也越来越严格,因此研究有关物质G的性质、控制生产过程中有关物质G的产生、降低药品中有关物质G的含量非常关键。由于克拉维酸钾中有关物质G的标准品的价格极其昂贵,严重限制了对其性质的研究。

图1 有关物质G的分子结构式Fig.1 The molecular structure of the related substance G

作者分别采用酸酐法和酰氯法合成克拉维酸钾有关物质G,并通过LC-MS/MS对所合成物质进行了结构鉴定,以期为研究有关物质G的生成机制、控制方法和提高克拉维酸钾药品质量提供帮助。

1 实验

1.1 主要试剂与仪器

L-酪氨酸(生物纯)、琥珀酸酐(化学纯)、有关物质G标准品(Council of Europe-EDQM CS 30026F-67081 Strasbourg Cedex)、氯化锂、冰醋酸、乙酸乙酯、碳酸氢钾、无水乙醇、乙腈(色谱纯)、三氟乙酸、丁二酰氯、四氢呋喃、硫酸。所用试剂除注明外均为分析纯。

R-1001N型旋转蒸发仪,循环水式真空泵,HDM-250B型电加热套,DLSB型低温冷却循环泵,梅特勒AL104型分析天平,LGJ-10型冷冻干燥机,DZF-6050B型真空干燥箱,Agilent 1100型液相色谱仪,北京创新通恒制备色谱仪(50 m L泵,UV检测器,5 m L定量环),Agilent 1200-6410型液相质谱仪。

1.2 合成方法

1.2.1 酸酐法

称取7.81 g L-酪氨酸和6.00 g琥珀酸酐放入250 m L三口烧瓶中,加入50 m L冰醋酸和0.2 g氯化锂,放入电热套中加热,常压下缓慢升温至95℃,搅拌回流反应1.0 h。将反应液减压蒸馏至无液体滴出后,向三口烧瓶中加入50 mL纯水,搅拌溶解,再用50 mL乙酸乙酯萃取水相3次,合并乙酸乙酯相。将乙酸乙酯萃取液置于低温冷却循环泵中,-20℃冷冻除水,过滤去除冰渣。向除水后的乙酸乙酯相中加入20 m L 20%碳酸氢钾溶液进行反萃,搅拌20 min后,静置,分出重相液,向其中加入1 L无水乙醇,室温下养晶1 h。抽滤,滤饼80℃真空干燥2 h,得有关物质G粗品。

图2 酸酐法合成有关物质G的化学反应式Fig.2 Chemical reaction of synthesis of the related substance G by acid anhydride method

1.2.2 酰氯法

称取5.40 g L-酪氨酸放入250 m L三口烧瓶中,加入120 m L饱和碳酸氢钾溶液并将三口烧瓶置于低温冷却循环泵中,0℃下缓慢滴加含有0.12 mol丁二酰氯的四氢呋喃溶液80 m L。滴加完毕后,保持0℃反应6 h。将反应液30℃减压蒸馏至无液体滴出后,向三口烧瓶中加入50 m L水溶解并用18%H2SO4调p H值至1.4。加入等体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯相。后续操作同1.2.1。

图3 酰氯法合成有关物质G的化学反应式Fig.3 Chemical reaction of synthesis of the related substance G by acyl chloride method

1.3 制备液相色谱法纯化有关物质G

称取有关物质G粗品适量,加水溶解制成浓度约为20 mg·m L-1的溶液,进制备液相色谱。从制备液相色谱中接出的溶液,经高效液相色谱检测确定为纯有关物质G后收集,减压蒸馏至没有液体蒸出后,冷冻干燥,得白色晶体有关物质G。

色谱条件:C18色谱柱(30 mm×250 mm,10μm);流动相:10%乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液;流速:30 m L·min-1;检测波长:280 nm;进样量:5 m L。

1.4 测试与表征

1.4.1 高效液相色谱分析[5]

1.4.1.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:10%乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液;流速:1 m L·min-1;柱温:40℃;检测波长:280 nm;进样量:20μL。

1.4.1.2 溶液的配制

标准品溶液:精密称取克拉维酸钾有关物质G标准品适量,加水溶解并制成浓度约为0.15 mg·m L-1的溶液,作为标准品溶液。

供试品溶液:精密称取供试品适量,加水溶解并制成浓度约为0.15 mg·mL-1的溶液,作为供试品溶液。

1.4.1.3 样品检测

取标准品溶液和供试品溶液分别进样,用外标法计算供试品含量。

1.4.2 结构鉴定

采用LC-MS/MS对所合成物质进行结构鉴定。

离子化方式:ESI;离子模式:负离子;色谱柱:Inertsil ODS-3(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相:10%乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液;流速:1 m L·min-1; UV检测器:280 nm;MS检测器:MS2 scan,product scan,collision energy 5V。

2 结果与讨论

2.1 反应路线的选择

在欧洲药典中,有关物质G又称为N-Succinyltyrosine[6],该物质中含有L-酪氨酸和琥珀酸的结构,其中L-酪氨酸在发酵培养基中属于常见物质,琥珀酸是细胞代谢三羧酸循环中的重要物质[7,8],二者有可能在某种酶的催化下形成酰胺键进而生成有关物质G,因此推测有关物质G极可能是在发酵过程中产生的。化学合成中常用的酰胺键生成方法有酸酐法和酰氯法[9]。

研究表明,作为酰化剂时酸酐的活性比相应的酰卤弱,反应速度比酰卤慢[9]。但本研究中对比两种合成方法发现,酰氯法的反应时间比酸酐法要长很多,有关物质G的纯度和收率也比酸酐法低,经过多次实验对酰氯法合成条件进行调整后,有关物质G的最高纯度为52.6%,总收率为46.0%;而酸酐法合成的有关物质G粗品纯度达到87.4%,收率为85.7%。因此,选择酸酐法作为合成有关物质G的路线。

2.2 反应溶剂的选择

由于L-酪氨酸的溶解性较差,所以选择合适的反应溶剂很关键。在碱性条件下有利于氨基酸类物质酰化反应的进行[10],首先选择水、二甲基甲酰胺、二甲苯、氯仿等作为溶剂,结果均没有有关物质G生成;L-酪氨酸易溶于甲酸,因而选用甲酸作为溶剂,虽然有有关物质G生成,但反应副产物很多,纯度最高仅能达到40%;进而选用冰醋酸作为溶剂,L-酪氨酸和琥珀酸酐反应较为充分,合成有关物质G的含量较高。因此,最终选择冰醋酸作为反应溶剂。

2.3 反应物料配比对反应的影响

在反应温度为95℃、反应时间为1.0 h的条件下,考察反应物料配比(L-酪氨酸和琥珀酸酐摩尔比,下同)对有关物质G收率和纯度的影响,结果如图4所示。

图4 反应物料配比对有关物质G收率和纯度的影响Fig.4 Effect of reactants ratio on yield and purity of the related substance G

从有关物质G的结构上分析,琥珀酸酐和L-酪氨酸的反应摩尔比为1∶1。但是由于琥珀酸为二元酸,若L-酪氨酸过量,则有可能与L-酪氨酸形成2个酰胺键,生成较多的副产物。而琥珀酸酐过量则有利于与L-酪氨酸形成1个酰胺键,生成较多的有关物质G,同时使L-酪氨酸反应更充分。但琥珀酸酐过量太多,则会有大量的琥珀酸酐未反应造成浪费,同时也不利于后期纯化。由图4可知,物料配比为1∶1.5时,有关物质G粗品的收率最高,达到85.7%,纯度达到87.4%。因此,选择适宜的物料配比为1∶1.5。

2.4 反应温度对反应的影响

在物料配比为1∶1.5、反应时间为1.0 h的条件下,考察反应温度对有关物质G收率和纯度的影响,结果如图5所示。

图5 反应温度对有关物质G收率和纯度的影响Fig.5 Effect of reaction temperature on yield and purity of the related substance G

虽然很多酰化反应属于放热反应[11],低温条件下有利于反应向所期望的方向进行。但由于L-酪氨酸的溶解性较差,导致其在反应溶剂中的浓度很低,反应速度很慢,因此需要升高反应温度以加快反应速度。由图5可知,随着反应温度的升高,反应速度加快,有关物质G的收率逐渐上升,在95℃时达到最高;但反应温度过高,超过95℃后容易引起副反应发生,导致副产物增多,有关物质G的收率和纯度反而下降。因此,选择适宜的反应温度为95℃。

2.5 反应时间对反应的影响

在物料配比为1∶1.5、反应温度为95℃的条件下,考察反应时间对有关物质G收率和纯度的影响,结果如图6所示。

图6 反应时间对有关物质G收率和纯度的影响Fig.6 Effect of reaction time on yield and purity of the related substance G

由图6可知,反应时间为0.5 h时,反应时间太短,反应不充分,有关物质G的收率和纯度分别只有40.9%、41.3%;当反应时间为1.0 h时,收率和纯度最高,分别为85.7%、87.4%;而反应时间过长时,副产物增加,收率和纯度反而下降,如反应4.0 h时的收率和纯度分别为35.6%、41.2%。因此,选择适宜的反应时间为1.0 h。

2.6 液相色谱分析

酸酐法合成有关物质G的粗品最高纯度为87.4%,含有较多杂质,其液相色谱见图7a。利用制备液相色谱[12]对有关物质G粗品进行纯化,纯化后的有关物质G的液相色谱见图7b。

由图7可知,纯化后的有关物质G的谱峰单一,经计算纯度为99.6%。经统计分析,酸酐法合成有关物质G的总收率为68.6%。

2.7 LC-MS/MS结构鉴定

采用LC-MS/MS对合成的物质进行结构鉴定,其二级质谱谱图如图8所示。

经LC-MS/MS分析,所合成物质的结构与欧洲药典中标示的克拉维酸钾中有关物质G(4-[[1-Carboxy-2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]amino]-4-oxobutanoic acid)的化学结构相符,即该物质为N-琥珀酰酪氨酸(N-Succinyltyrosine)。

图7 有关物质G粗品(a)和纯品(b)的液相色谱Fig.7 The chromatograms of crude product(a)and pure product(b)of the related substance G

有关物质G的可能裂解路径及产物离子的可能结构见图9。

图8 特征离子m/z280的二级质谱图Fig.8 Two stage mass spectrum of characteristic ions m/z280

图9 特征离子m/z280的可能裂解路径及可能的结构Fig.9 Predicted cracking path and possible structure of characteristic ions m/z280

3 结论

(1)以L-酪氨酸和琥珀酸酐为原料、氯化锂为催化剂、冰醋酸为溶剂合成了克拉维酸钾中有关物质G,在L-酪氨酸和琥珀酸酐的摩尔比为1∶1.5、95℃加热反应1.0 h的优化条件下,有关物质G粗品的最高纯度达到87.4%,收率为85.7%。

(2)经高效制备液相色谱纯化,有关物质G的纯度达到99.6%,总收率为68.6%。

(3)通过LC-MS/MS表征,确定合成产物为欧洲药典标示的克拉维酸钾中有关物质G。

(4)该方法可以较大规模地制备有关物质G,便于对其性质进行研究,进而降低该物质在克拉维酸钾中的含量,最终提高克拉维酸钾的产品质量。

[1] Aharonowitz Y,Demain A L.Carbon catabolite regulation of cephalosporin production in Streptomyces clavuligerus[J].Antimicrob Agents Chemother,1978,14(2):159-164.

[2] Haginaka Jun,Nakagawa Terumichi,Toyozo Uno.Stability of clavulanic acid in aqueous solutions[J].Chem Phara Bull,1981,29 (11):3334-3341.

[3] Saudagar P S,Survase S A,Singhal R S.Clavulanic acid:A review [J].Biotechnology Advances,2008,26(4):335-351.

[4] 刘宝树,王静康,龚俊波,等.克拉维酸钾反应结晶研究[J].中国抗生素杂志,2005,30(11):656-698.

[5] Yu Yihua,Ye Lei,de Biasi Vern,et al.Removal of the fermentation by-product succinyl L-tyrosine from theβ-lactamase inhibitor clavulanic acid using a molecularly imprintde polymer[J].Biotechnology and Bioengineering,2002,79(1):23-28.

[6] European Pharmacopoeia 5.0,2278-2279.

[7] 王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学(第三版下册)[M].北京:高等教育出版社,2002:97-98.

[8] 管桂萍,王红兵,田杰生.琥珀酸对产酸克雷伯氏菌好氧发酵甘油产1,3-丙二醇的影响[J].食品与发酵工业,2008,34(5):23-27.

[9] 黄宪,王彦广,陈振初.新编有机合成化学[M].北京:化学工业出版社,2002:472-477.

[10] 胡宏纹.有机化学[M].北京:高等教育出版社,1990:662-664.

[11] 龚报森.有机化学实验[M].西安:陕西科学技术出版社,1998: 140-141.

[12] 王学军,赵锁奇,王仁安.制备色谱技术进展[J].青岛大学学报, 2001,16(4):92-94.

Chemical Synthesis and Structural Identification of the Related Substance G in Clavulanate Potassium

CHEN Fang1,JIN Xiao-qing1,CAO Guang-xiang1,ZHANG Xiao-xiao1,WANG Shan-shan2,ZHONG Chuan-qing2
(1.Research and Development Department of Lunan Pharmaceutical Group,Linyi 276000,China; 2.School of Municipal and Environmental Engineering,Shandong Jianzhu University,Jinan 250101,China)

The related substance G in clavulanate potassium was synthesized from L-tyrosine and succinic anhydride in glacial acetic acid with lithium chloride as catalyst.Effects of type of reaction solvent,reactants ratio,reaction temperature and reaction time on the yield and purity of the related substance G were studied.Under the optimum conditions as follows:the molar ratio of L-tyrosine to succinic anhydride was 1∶1.5,the reaction temperature was 95℃,the reaction time was 1.0 h,,the purity and yield of the related substance G reached 87.4%and 85.7%,respectively.Preparative liquid chromatography was used for purification,while the purity reached 99.6%and the total yield reached 68.6%.The structure of the substance synthesized was proved to be the same as that of the related substance G in European Pharmacopoeia by LC-MS/MS.

clavulanic acid;related substance G;chemical synthesis;structural identification

R 978.11

A

1672-5425(2013)01-0084-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.01.22

2012-08-14

陈仿(1982-),女,江苏邳州人,助理工程师,研究方向:生物制药工程;通讯作者:钟传青,博士,副教授,E-mail:zhongchq @163.com。