小鼠视神经炎视同模型的建立及评估

周欢粉，魏世辉，李晓明

特发性脱髓鞘性视神经炎（idiopathetic demyelinated optic neuritis，IDON）是视神经常见的一种炎性脱髓鞘性疾病，具有自限性，可导致急性视力下降。视神经炎的病理特征主要表现为髓鞘脱失。实验性自身免疫性脑脊髓炎 （experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE）与脱髓鞘性视神经炎相比，在视觉诱发电位（visual evoked potentials，VEP）、磁共振成像和病理方面极其相似，并且EAE中VEP的潜伏期延长，类似多发性硬化 （mlltiple sclerosis，MS）和视神经炎（optic neuritis，ON）[1，2]。 目前，国际上普遍应用EAE模型来研究MS和ON，但制作模型的方法多种多样。本研究首次在国内建立MOG35－55多肽诱发的ON小鼠模型，为下一步广泛开展IDON发病机制和治疗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验用C57BL/6（H-2b）小鼠50只，雌雄不限，8~10周龄，由中国人民解放军总医院实验动物中心提供。动物饲养于室温24℃的环境中，维持光/暗12 h循环交替，并给予充足的食料和洁净饮水。饲养2~7 d，用于实验。

1.1.2 主要试剂 鼠源 MOG35－55多肽 （MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）：北京赛百盛基因技术有限公司合成，采用反高校液相色谱仪（C18柱）分离纯化，纯度在95%以上；完全弗氏佐剂（CFA）购自美国Sigma公司；百日咳菌苗和结核杆菌冻干粉均购自北京天坛生物制品研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 50只C57BL/6小鼠随机分为2组：对照组10只、EAE模型组40只。全部实验小鼠取右眼为实验对象。

1.2.2 实验性视神经炎小鼠模型的建立及神经功能评分 将 300 μg MOG35-55溶于 200 μl PBS液，再与200 μl CFA混合，添加结合杆菌使其终浓度为2 mg/ml，用电子搅拌棒冰浴下搅拌5~10 min达到充分乳化（判断方法：将1滴乳剂滴入水中，如不散开漂在水面则为乳化完全；如立即散开，则未乳化充分）。以上操作尽量在避光、低温、无菌条件下进行。EAE模型组双侧腹壁分四点皮下注射混合乳剂，对照组直接将 200 μl PBS液和 200 μl CFA充分乳化后分双侧腹壁分4个点皮下注射。两组均于免疫前24 h和免疫后24 h每只小鼠腹腔注射100 μl百日咳菌液（含活菌 2×109个）。 每天由观察者记录每只小鼠的体重并进行神经功能评分，直至免疫后的30 d。

神经功能评分标准：0分：无临床症状；1分：尾部张力降低或轻度步态笨拙；2分：尾部无张力或中度步态异常，双后肢无力,被动翻身后可以恢复；3分：双后肢瘫痪,被动翻身后不能恢复,但给予刺激后可以挪动；4分：双后肢瘫痪,前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；5分：濒死状态或死亡。

1.2.3 光镜下病理形态学 在免疫后第7、14、20、30天，对照组取2只小鼠、EAE模型组10只小鼠用4%多聚甲醛溶液经心脏灌注，钝性分类视神经，暴露视交叉，在视交叉处及球后0.5 mm处剪断视神经。对视神经采用HE染色、LFB髓鞘染色和Bielschowsky轴突银染，分别评估炎性细胞浸润、髓鞘脱失和轴突的病理改变。

1.2.4 电镜超微结构的观察 对照组和EAE模型组分别于免疫后第7、14、20、30天做完电生理检查后，各随机选取1只眼，1%戊苯巴比妥0.15 ml/只腹腔麻醉后，取出视神经，用于透射电镜的观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包进行分析，实验数据采用均数±标准差（x±s）表示。对数据进行正态检验后，对各独立样本的均数进行t检验。以P<0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1 MOG35－55免疫小鼠模型建立、体重变化和神经功能评分 本实验用C57BL/6小鼠，以MOG35-55多肽为抗原制备MS和ON的动物模型，该模型为慢性进行型MS的模型。除在免疫后的第7天处死的10只小鼠外，其余EAE模型组30只小鼠全部发病，免疫后第2天起及随后的1周时间内小鼠体重轻度下降，此间没有出现运动功能障碍,评分均为0分；实验小鼠在免疫后的第10天陆续发病，平均发病时间为（14.1±1.48）d。第20天时，小鼠的平均临床评分达到高峰。以后小鼠的临床症状有轻微的降低，但是维持在一个较高的水平。患病小鼠表现为精神萎靡、体重下降、尾无力、松弛、下垂，后肢或四肢麻痹、大小便失禁，个别小鼠表现为共济失调。对照组无一发病。

2.2 视神经组织形态学的改变

2.2.1 光镜观察 EAE模型组用于研究发病率的20只小鼠（40眼）其中有23眼视神经 LFB染色示不同程度的脱髓鞘改变（雌性小鼠12眼，雄性小鼠11眼，两组无明显差异）。对照组小鼠视神经纵切面HE染色可见神经纤维排列整齐，染色均匀，无炎性细胞浸润。LFB染色见髓鞘被染成均匀的蓝色，排列致密整齐。视神经横切面Bielsehowsky轴突银染显示轴突被染成黑色，背景呈黄棕色。CON小鼠直至免疫后的第30天视神经病理未发生明显改变。EAE模型组在免疫后的第7天，小鼠视神经HE染色和 Bielsehowsky轴突银染与对照组对比均无明显改变；LFB染色可见髓鞘排列紊乱，失去明显条索结构，但无髓鞘脱失。在免疫后的第14天，视神经纵切面 HE染色见中度炎性细胞浸润。LFB染色示病灶处不规则片状髓鞘脱失，髓鞘脱失严重，边界欠清晰。Bielsehowsky轴突银染可见视神经轴突组织溶解，轴突疏松减少。在免疫后的第20天，EAE模型组视神经HE染色和免疫后的第14天无明显区别，LFB染色可见大范围髓鞘脱失，边界清晰。Bielsehowsky轴突银染可见视神经轴突结构紊乱，疏松减少，空泡化明显。在免疫后的第30天，视神经HE染色炎性细胞数目相对减少，LFB染色可见脱失的再生薄层髓鞘，染色较浅。Bielsehowsky轴突银染仍可见严重的轴突组织溶解减少，间质空泡化。

2.2.2 视神经超微结构的改变 在透射电镜下分别观察对照组组、EAE模型组在免疫后的第7、14、20、30天各1只VEP改变眼的视神经超微结构。电镜所见：对照组C57BL/6小鼠视神经超微结构（图1A）：正常视神经纤维较细，神经轴索为排列整齐的板层髓鞘所包绕,髓鞘完整、密度均匀;轴索内可见大量的微丝及呈长椭圆形的少量线粒体。免疫后的第7天大部分有髓纤维结构正常，髓鞘呈板层状排列，包裹中央的轴突，轴索完整，细胞器正常；少数髓鞘层状结构排列疏松或断裂，与轴突间有间隙形成，线粒体轻度水肿（图1B）。免疫后的第14天，髓鞘分层明显，呈洋葱皮样改变，轴突轴膜与髓鞘间有间隙形成，可见不同程度的髓鞘板层状分离、变薄、脱失。轴索水肿，电子密度低，个别轴索内线粒体明显肿胀，嵴短而少或溶解（图1C）。免疫后的第20天，脱髓鞘的神经纤维增多，轴突与髓鞘间间隙增大，轴索内微丝溶解较明显而呈空泡状，微管消失（图1D）。免疫后的第7天，轴突变性、水肿逐渐减轻，轴索周围髓鞘脱失出现重建的薄层髓鞘，表明少突胶质前体细胞迁移到脱髓鞘区进行髓鞘重建（图 1E）。

3 讨 论

视神经炎的动物模型主要包括中枢神经系统（central nervous system，CNS）髓鞘抗原免疫诱导的EAE 模型[3]、病毒诱导的脱髓鞘模型[4，5]和抗体诱导的脱髓鞘模型[6]。由于EAE模型与人类特发性脱髓鞘性视神经炎在病理、MRI和VEP方面有许多相似之处，常用来作为MS和ON的实验模型。当前，国内外主要通过髓鞘蛋白诱发建立EAE模型，即髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 （MOG）、髓鞘碱性蛋白（MBP）和髓鞘蛋白脂蛋白（PLP）。由于MOG存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层,具有高度免疫原性，在视神经髓鞘上的含量比CNS和脊髓都要多，且已经发现唯有针对MOG的抗体能够在体内和体外造成脱髓鞘[7，8]，许多证据证明MOG和抗MOG抗体在ON的发病过程中起重要作用。人工合成的MOG35－55多肽片段代表其免疫显性区域[9]，用于视神经炎小鼠模型的建立，效果更明显。此研究就是用MOG35－55多肽作为唯一的免疫原。

本实验用MOG35－55诱发C57BL/6小鼠制备的EAE模型，具有慢性进行性特点。EAE实验组小鼠突出表现为活动性降低、进食减少、体重减轻和皮毛不光滑。同时，小鼠出现了明显的神经系统体征：以尾无力下垂、双后肢瘫痪多见，四肢瘫痪或单肢瘫痪的较少。在此基础上，笔者进行了病理分析：EAE组用于研究发病率的20只小鼠（40眼）其中有23眼视神经LFB染色示不同程度的脱髓鞘改变，VEP检查结果发生明显改变时处死小鼠，取5个不同切面视神经进行LFB染色，笔者以此抗原建立的视神经炎小鼠模型以眼计算发病率为57.5%（病理诊断）。一方面，Sbao等[9]应用MOG多肽诱导C57BL/6小鼠的发病率为70%，比笔者建立的视神经炎模型发病率略高，经分析笔者认为这主要与抗原的纯度以及百日咳菌素的活性有关，造成的发病率差异不会对实验模型的建立产生实质影响。另一方面，Bettelli等[1]在MOG－TCR特异的转基因小鼠成功建立单症状的视神经炎模型，虽然无脑部和脊髓的脱髓鞘改变，比较方便研究视神经炎，但费用昂贵，难于大范围开展普及研究。而使用MOG35-55多肽诱导C57BL/6小鼠诱发的EAE模型，也是一类国际上公认、较成熟的、较理想的EAE模型。国内虽然早已用此模型用于研究MS，但尚无建立此模型用于视神经炎的研究。目前国内对视神经的临床研究报道越来越多，但病因机制的基础研究较少。笔者建立的小鼠模型易复制，发病率高，经济适用，而且普及应用的前景比较乐观，便于对ON以及ON与MS的关系进行系统深入的研究。这和笔者的研究初衷是一致的。

在实验过程中，笔者发现：在不同的时间点，视神经脱髓鞘后的病理变化不尽相同，这主要与本文模型的病理改变呈现节段性和局灶性，以及各动物的发病情况各不相同有关。同时，在光镜下，还发现：在免疫后的第7天，LFB染色可见髓鞘排列紊乱，但无明显脱髓鞘表现，电镜下观察到髓鞘断裂分层，与轴突分离，可见轻度的线粒体肿胀。这个问题，已有文献给予过报道，即以MOG或MOG特异T细胞免疫C57BL/6小鼠的视神经病变主要为炎症反应和髓鞘脱失[1]，这与笔者这次小鼠模型的建立取得的研究结果是一致的。本实验中观察到EAE组小鼠视神经呈现不同程度的髓鞘脱失和轴索的损害，很可能是视神经炎视力下降的病理基础，需要进行更深一步的研究。综上所述，笔者这次视神经炎小鼠模型，初步模拟了脱髓鞘性视神经炎的发生和发展过程，各项指标也基本符合建模标准和有关要求。

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