成年大鼠窦房结的解剖学定位和组织学特点的定量观察

刘燕青，　彭瑞云，　高亚兵，　王水明，　徐新萍，赵黎，　王晓民，　王惠，　董霁，　姚斌伟

(1. 军事医学科学院 放射与辐射医学研究所　北京 100850；2. 中国人民武装警察部队 后勤学院附属医院　天津 300162)

0　引言

1907年，英国的Keith和Flack[1]首次发现了窦房结(sinoatrial node，SAN)，因此国外文献中又把SAN称为Keith结、Keith-Flack结。SAN是心脏传导系统的重要组成部分，是哺乳动物心脏正常节律的起搏点、心脏自律活动的发源地，正常的SAN功能是心脏泵功能得以实现的前提条件。不同种属动物的SAN尽管在功能上非常相似，但在位置、形态、组织结构、细胞数目等方面存在诸多差异，而且又存在增龄性变化[2-4]。

大鼠是最常用的实验动物之一。关于大鼠SAN的解剖学位置，目前尚存争议。为了给心脏电生理学、病理学、药理学和临床研究提供正确的形态学依据，保证SAN电镜取材和SAN细胞急性分离研究取材的准确性，本研究对20只成年大鼠SAN的位置、形态、组织结构进行了观察。

1　材料和方法

1.1　实验动物

二级Wistar大鼠20只，雌雄不拘，鼠龄10 w左右，体重300±20 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2　大鼠SAN取材和切片方法

以1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腔，暴露心脏，沿上腔静脉远端、其他与心脏相连的大血管根部离断血管，取下完整心脏，沿右心耳下缘水平位切取心脏上半部分，立即置于4℃预冷的生理盐水中冲洗残留血液，10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋(采用上腔静脉立埋的方法)，用LEICA RM2255切片机自上腔静脉断端至右心房做水平连续切片，片厚3 μm。

1.3　大鼠SAN组织染色

切片隔5取1，行HE染色，光镜下观察以确定是否含有SAN组织。取含有SAN组织的阳性切片，每相邻2张为一组，一张行HE染色、一张行Masson染色，光镜下观察。

1.3.1大鼠SAN组织HE染色

石蜡切片经二甲苯(I、II、III)脱蜡各15 min，经无水乙醇(I、II)、95%乙醇(I、II)和90%乙醇各5 min，经80%、70%、50% 乙醇和蒸馏水各2 min，苏木精染色1 min，1%盐酸酒精分色数秒，自来水冲洗反蓝10 min后，蒸馏水稍洗，经伊红染液10 s，蒸馏水冲洗，再经50%、70%、80% 和90%乙醇各2 min，经95%乙醇(I、II、III)、无水乙醇(I、II)各2 min，最后经二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ )透明处理各10 min，中性树胶封片，光镜下观察。

1.3.2大鼠SAN组织Masson染色[5]

石蜡切片按常规方法脱蜡至水；3%氯化汞饱和苦味酸液固定40 min，流水冲洗5 min；0.5%冰醋酸处理1 s；再经丽春红酸性品红染色10 min，0.5%冰醋酸处理1 s；经1%磷钼酸溶液处理2 s，不经水洗，直接用1%亮绿复染3 min，再经1%冰醋酸Ⅰ、Ⅱ各处理2 s，然后经无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min，中性树胶封片，光镜下观察。

1.4　图像分析及定量方法

2　结果

2.1　成年大鼠 SAN位置

观察连续切片，结果表明成年大鼠SAN位于上腔静脉与右心房交界区及交界区以上的上腔静脉近段壁内(见图1A、B、C)，SAN组织位于内、外、腹侧上(前)腔静脉壁上，背侧静脉壁未见SAN组织分布。

A示SAN位于上腔静脉与右心房交界区以上部位上腔静脉壁内，呈正常组织结构；B示SAN位于上腔静脉与右心耳嵴交界区部位上腔静脉壁内；C示SAN位于上腔静脉与右心耳交界区部位。

A示SAN位于上腔静脉与右心房交界区以上部位上腔静脉壁内，呈正常组织结构；B示SAN位于上腔静脉与右心耳嵴交界区部位上腔静脉壁内；C示SAN位于上腔静脉与右心耳交界区部位。图1　正常成年大鼠SAN组织连续切片，黑色实线勾画区域示SAN组织(HE, 标尺=50 μm)。

2.2　大鼠SAN形态结构特点

光镜下SAN区组织结构较疏松，染色浅淡，与周围的心房肌或静脉壁平滑肌易于区分。大鼠SAN外形呈马蹄形/C形，由位于上腔静脉内侧壁上的内侧部和位于外侧壁上的外侧部以及位于腹侧壁上的连接内、外侧部的腹侧部组成(见图1A)。其中内侧部发育最好，多呈膨大状态，实质细胞成分最为密集，P细胞含量最多；外侧部和腹侧部发育得较差、较为薄弱。SAN所在部位，内侧达静脉内皮下，外侧达静脉外膜下，几乎占据静脉壁全层。

2.3　大鼠SAN动脉出现概率和形态特点

在大鼠SAN内部动脉出现的概率是100%，即SAN动脉，为1～3条不等，且以内侧部最为常见。本研究对20只成年大鼠SAN的观察结果表明，SAN动脉在内侧部的出现概率为15/20，在外侧部出现的概率为12/20，在腹侧部出现的概率为7/20。大鼠SAN动脉的形态特点为：动脉壁外膜含丰富的胶原纤维，使动脉壁显著增厚，这些胶原与结内胶原纤维网架结构相互连接，管壁胶原纤维外围常常有P、T细胞围绕(见图3A)。

2.4　大鼠SAN内细胞类型和形态特点

SAN内部主要由三种细胞成分：P细胞、T细胞和少量心房肌细胞。

P细胞多位于结的中央，散在分布或3～5个成群，较心房肌细胞小，外形多呈圆形、椭圆形、梭形或多边形。细胞核相对较大，呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，核染色较淡。由于胞浆内胞质丰富而细胞器相对较少，故使胞浆清亮发空，染色浅淡(见图2)。P细胞形态特点定量分析结果见表1。

T细胞又称过渡细胞，由于其大小、形态、细胞内部结构介于P细胞与心房肌细胞之间，故名。细胞多呈长圆柱形、梭形，较心房肌细胞短而窄。因细胞内肌原纤维、线粒体等细胞器较P细胞多，故染色介于P细胞与心房肌之间(见图2)。T细胞形态特点定量分析结果见表2。

表1　正常成年大鼠SAN内P细胞形态特点定量分析(μm)

表2　正常成年大鼠SAN内T细胞形态特点定量分析(μm)

图2　正常成年大鼠SAN内的P、T细胞(HE染色)

2.5　大鼠SAN间质形态特点

成年大鼠SAN除以上实质细胞外，结内还含有一些纤维细胞和成纤维细胞，SAN动脉在结内逐渐分支为微动脉和毛细血管网，在SAN外周还可见到神经节分布。 结内细胞间含有较多胶原纤维，Masson三色染色结果显示：大鼠SAN内胶原纤维含量较多，其内部以绿色的胶原纤维为网架，各种细胞成分就分布在这些网架结构的间隙中。SAN动脉管壁较厚，含丰富的胶原纤维，构成管壁支架，与周围组织内的胶原纤维网架相互连接(见图3A)。结内细胞排列松散，染色较淡，整个结区与结外结构分界清晰。细胞胞浆染色与细胞内肌原纤维含量有关，位于SAN边缘的普通心房肌细胞染色最深，T细胞染色介于心房肌和P细胞之间，P细胞染色最浅(见图3B)，胶原纤维定量分析结果见表3。

A. ★示窦房结动脉，其管壁外膜含丰富的胶原纤维；B. 示SAN内胶原纤维呈网架结构，各种细胞成分位于网架间隙中。图3　正常成年大鼠SAN内胶原纤维 (Masson染色，标尺=50 μm)

IOD值面密度值1.58±0.661.51±0.35

本研究所观察的20只成年大鼠SAN位置及形态特点未见明显雌雄性别差异以及较大的个体差异。

3　讨论

大鼠SAN解剖位置比较隐蔽，体积又非常小，通过肉眼观察难以发现，但其在心脏自律性活动中占有重要地位，因此对大鼠SAN进行准确定位对相关的临床和础实验研究工作非常重要。

关于心脏SAN的切取方法，Chandrasiri认为通过大体和体视显微镜确定其部位有技术上的困难，只有通过连续切片才能成功地进行研究[6]。已有的研究表明，人及大多数哺乳类动物SAN的位置大致位于上腔静脉与右心耳交界处以下，呈枣核形，结的长轴与界沟平行，大多数偏静脉窦侧，结的上端可达界沟与右心耳嵴交界处，下端可达下腔静脉口。大鼠是最常用的实验动物之一，关于大鼠SAN的解剖学位置，国内外虽有文献报道，但目前尚存争议[3，7-14]。本研究对20例成年Wistar大鼠SAN的观察结果表明：成年大鼠SAN位于上腔静脉与右心房交界区及交界区以上的上腔静脉近段壁内，呈马蹄形/C形；大鼠SAN的位置、形态特殊，与人及大多数哺乳类动物存在明显差异。目前部分研究对大鼠SAN的取材部位仅仅依据人或其他哺乳类动物(如兔、猴、犬等)的SAN位置，而我们通过连续切片的方法对成年大鼠SAN进行了详细的定位研究。大鼠SAN这种特殊的位置提示我们：在进行成年大鼠SAN取材时需保留上腔静脉的近心段。

张炎等[9]的研究表明，新生SD大鼠SAN位于上腔静脉与右心房交界处以上的上腔静脉近侧段壁内，呈马蹄形，亦即新生SD大鼠SAN组织全都位于上腔静脉近侧段上，并未延伸到右心房。本研究的观察结果表明，成年Wistar大鼠SAN位于上腔静脉近侧段上并延伸至上腔静脉与右心房交界区。从SAN位置角度比较，新生SD大鼠位置较成年Wistar大鼠偏高，导致这种现象产生的可能原因：(1)不同种属大鼠SAN位置存在差异；(2)不同种属大鼠SAN位置基本一致，但其位置存在生后继续发育，即随鼠龄增长其位置逐渐发生下移。导致以上位置差异的具体原因有待进一步研究。

一些资料认为SAN原基出现后，会随着胚胎发育而呈现位置迁移。最初，SAN原基可出现于静脉窦壁或窦房环，随着胎龄的增加，到出生后直至成年SAN最终可迁移至界嵴附近或迁移至上(前) 腔静脉入口以下从腔耳角向外下沿界嵴到下腔静脉口这一范围。如果有些动物出生时及生后静脉窦一直存在，与静脉窦演化有关的生后的上腔静脉壁就可能是SAN组织存在的部位，在确定SAN位置时，上 腔静脉近侧段也不能排除在外[9]。因此，我们在取材时保留了近心段上腔静脉。这里要指出的是：本研究观察了10周龄Wistar大鼠SAN的位置和形态，由于大鼠SAN可能存在生后继续发育，因此如果研究Wistar乳鼠或老龄Wistar大鼠的SAN，应注意与本文结果可能有所不同。

人类SAN动脉恒定存在，因其一般穿过结的中央，故又名SAN中央动脉。但在一些哺乳类动物中，SAN动脉并非位于SAN中央，有的位于结的周边，甚至有的未见SAN动脉。本研究结果表明，大鼠SAN内动脉恒定存在，一般为1～3条，多位于SAN内侧部和/或外侧部；同时本研究对20例大鼠SAN内各部动脉数量进行了详细的统计，目前尚未见关于大鼠SAN动脉的相似报道。

与人及其他哺乳类动物相比，大鼠SAN的结构特点是结内胶原纤维含量丰富，组织结构疏松。HE染色后的SAN区与周围组织相比着色较浅，因此肉眼观察即可粗略定位。

虽然大鼠SAN位置、形态与人及大多数哺乳动物存在差异，但结内细胞成分各家报告基本一致，主要由P、T和少量心房肌细胞构成。P细胞最小，细胞核相对较大，胞浆细胞器含量最少，染色最浅；心房肌细胞最大，胞浆细胞器含量最多，染色最深；T细胞大小、形态、染色介于前二者之间。李澈等[10]利用解剖显微镜观察在体大鼠心脏最早起搏点确定SAN位置，对SAN细胞的观察结果表明：P细胞以柱状和短杆状较多，短径在5～10 μm，长径可达10～25 μm。我们采用组织连续切片的方法确定SAN位置，观察到的P细胞呈圆形、椭圆形、梭形，细胞图像分析结果表明：P细胞短径为6.36±0.68 μm，长径为8.86±0.52 μm。究竟哪种P细胞的形态确切，尚待进一步实验证实。

关于SAN组织细胞的起源，目前主要有两种观点: ①混合来源，认为SAN组织分别来源于神经组织和心肌，即把SAN等传导组织看作是神经与心肌最终的混合体[15]；②单纯心肌来源，认为SAN起源于胚胎期窦房环中原始、未分化、幼稚的特化心肌细胞。目前多数学者支持后者，即SAN细胞与普通心房肌、心室肌细胞都起源于心肌干细胞[16]。因此，P细胞在形态和结构上与胚胎时期的原始、幼稚的心肌细胞相似，也具有Purkinje细胞的某些特点。

综上所述，大鼠SAN与人及多数哺乳类动物在位置、形态、组织结构等方面存在诸多差异，而且又可能存在位置的增龄性变化，上述研究结果对正确判断实验结果、确定准确的电镜取材部位和分离传导细胞进行体外培养等均有重要意义。