CD62L、MadCAM-1表达与非小细胞肺癌淋巴结转移关系

曹宝森 李 霞 康 剑云 常 茂叶 张 凡 刘 宝生 王新生

成熟淋巴细胞归巢到特定区域是穿越高内皮微静脉并进入外周器官的定向迁移，是一个高度调节的过程，关键步骤包括贴壁、滚动，粘附、捕获及迁移。而肿瘤淋巴结转移中的作用机制尚不清楚，但与淋巴归巢有相似之处。CD62L表达上调在T细胞贴壁滚动过程中发挥重要作用。黏膜地址素细胞粘附分子(MadCAM-1)是外周淋巴结血管地址素，与相应受体的结合诱导淋巴细胞的游走和归巢过程，然而关于CD62L、Mad-CAM-1在非小细胞肺癌表达研究尚少。笔者通过免疫组化染色分析CD62L、MadCAM-1在非小细胞肺癌、转移淋巴结和正常肺组织、无转移淋巴结中的表达，探讨CD62L、MadCAM-1表达与肺癌发展以及淋巴结转移之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2007年1月至2011年12月河北北方学院附属第二医院、河北北方学院附属第一医院住院的手术切除后经病理诊断为非小细胞肺癌患者60例，其中腺癌20例，鳞癌24例，腺鳞癌10例，大细胞未分化癌6例;肺癌转移淋巴结30例，无肺癌转移淋巴结30例，正常肺组织30例。所有患者术前未经化疗和放疗，无其他恶性肿瘤史。所有标本均经病理确诊。

1.2 免疫组化染色 一鼠抗人单克隆抗体购自武汉博士德试剂公司，组织石蜡块包埋，4 μm连续切片。主要免疫组化步骤:二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，微波炉进行抗原热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗 、三抗各1 h，DAB显色10～15 min，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞＜10%为阴性，＞10%为阳性。CD62L阳性物质定位在肿瘤细胞质和细胞膜，MadCAM-1阳性部位定位在高内皮微静脉内皮细胞浆和细胞膜。采用HIPAS100图象分析软件对所有切片进行图象分析，首先低倍镜寻找每张切片着色的典型区域，每张切片随机选取10个着色典型区域且不重复的视场，放大400倍镜下测量每个视场中阳性灰度单位，取其均数即为该切片的着色强度(即灰度单位)。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标在同一组间的表达水平以及与浸润程度之间作直线回归相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD62L的表达率情况 CD62L在肿瘤组织中表达在肿瘤细胞、脉管内癌栓、间质浸润的淋巴细胞;在转移淋巴结主要表达在转移灶肿瘤细胞、脉管内癌栓以及淋巴细胞;在正常肺组织以及无转移淋巴结主要表达在成熟淋巴细胞;CD62L在癌组织中表达高于正常肺组织(P＜0.05);转移淋巴结中的表达高于无转移淋巴结表达(P＜0.05);CD62L在转移淋巴结中表达与癌组织中的表达相比无差异(P＞0.05);CD62L在正常肺组织表达与无转移淋巴结表达无差异(P＞0.05);CD62L在癌组织中阳性表达率65%(39/60)明显高于正常肺组织10%(3/30)(P＜0.05);转移淋巴结中的阳性表达率70%(21/30)明显高于无转移淋巴结阳性表达率17%(5/30)(P＜0.05);CD62L在转移淋巴结中表达率与癌组织中的表达率相比无差异(P＞0.05);CD62L在正常肺组织表达率与无转移淋巴结表达率无差异(P ＞0.05)。

2.2 MadCAM-1的表达率情况 MadCAM-1主要表达淋巴结滤泡间区的高内皮后微静脉内皮细胞;在癌组织中的高内皮微静脉无表达;转移淋巴结中的阳性表达率70%(21/30)高于无转移淋巴结表达率40%(12/30)。

2.3 CD62L、MadCAM-1表达水平与肺癌临床病理特征的关系CD62L的阳性表达水平(即灰度单位)与淋巴结转移、脉管内癌栓、TNM分期之间存在密切相关，与肿瘤体积、细胞分化程度、侵犯肺膜无关;MadCAM-1的阳性表达水平与淋巴结转移、脉管内癌栓、肿瘤体积存在明显相关，与细胞分化、侵犯肺膜、肿瘤分期无明显相关。见表1。

2.4 CD62L、MadCAM-1表达水平间的相关分析 CD62L及其受体MadCAM-1表达在肺癌组织以及转移淋巴结中表达之间存在密切相关(r=0.7081，P=0.002);CD62L及其受体Mad-CAM-1表达在肺癌组织以及无转移淋巴结中表达之间不存在相关(P ＞0.05)。

3 讨论

肿瘤细胞向远隔器官的转移是有选择性而非随机的，非常类似淋巴细胞的归巢现象，目前有3种理论来解释这种归巢现象:(1)选择性生长，即肿瘤细胞从血液循环或者淋巴循环向组织内的渗透是广泛存在的，但只在具有适合的生长因子和细胞外基质的环境中生存。(2)肿瘤细胞只选择性地在归巢器官的内皮表面附着生长。(3)肿瘤细胞只向产生特异的水溶性的吸附因子的器官趋化。上述机制在实验动物的转移观察中或多或少存在，但目前的实验证据还无法完全解释肿瘤细胞的偏好性转移。

表1 CD62L、MadCAM-1在非小细胞肺癌的表达水平与临床病理特征的关系±s

表1 CD62L、MadCAM-1在非小细胞肺癌的表达水平与临床病理特征的关系±s

注:tc代表CD62L;tM代表MadCAM-1

病理参数 CD62L MadCAM-1 t值 P值临床分期Ⅰ、Ⅱ期(n=36) 26.3 ±3.4 21.0 ±2.2 t c=4.9921 ＜0.05Ⅲ、Ⅳ期(n=24) 42.3 ±3.5 22.4 ±2.0 t M=2.5406 ＞0.05肿瘤直径(cm)≤3(n=25) 22.3 ±1.7 23.3 ±1.4 t c=2.8451 ＞0.05＞3(n=35) 22.1 ±3.7 34.3 ±3.0 t M=4.6723 ＜0.05分化程度高分化(n=30) 21.0 ±2.1 25.3 ±4.9 t c=2.2917 ＞0.05中、低分化(n=30) 24.2 ±3.0 23.8 ±2.1 t M=2.3453 ＞0.05有无淋巴结转移无淋巴结转移(n=30) 22.2 ±1.3 21.5 ±2.0 t c=5.6632 ＜0.05淋巴结转移(n=30) 40.5 ±2.6 40.4 ±1.6 t M=6.3346 ＜0.05有无浸润未浸润肺膜(n=35) 22.2 ±1.7 22.2 ±1.9 t c=1.8042 ＞0.05浸润肺膜(n=25) 21.5 ±2.5 22.5 ±2.6 t M=2.0216 ＞0.05有无脉管内癌栓无脉管内癌栓(n=32) 21.7 ±2.6 23.2 ±3.7 t c=4.7802 ＜0.05有脉管内癌栓(n=28) 32.4 ±4.9 40.2 ±5.0 t M=5.0216 ＜0.05

淋巴细胞归巢的关键步骤是贴壁，而CD62L介导的淋巴细胞与内皮细胞的初始粘附在此过程中起关键作用。CD62L又称淋巴细胞归巢受体(lymphocytehoming receptor，LHR)。由Gallatin和Tedder等首先在小鼠淋巴细胞上发现，其分子质量为140 kD，CD62L分子内具有类似凝集素样的细胞外结构，通过钙依赖性方式与细胞表面糖蛋白相互作用。CD62L表达于大多数B细胞和未致敏T细胞以及多数单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞［1］。CD62L通过识别外周淋巴结高内皮静脉(HEV)内皮细胞表达的外周淋巴结地址素(peripheral node addressins，PNAd)介导淋巴细胞归巢到外周淋巴结。CD62L的正常功能是作为淋巴细胞到达外周淋巴结的归巢受体［2］。而Alcaide等用胰岛素启动子调控猴病毒40T抗原表达的转基因鼠可产生特异向肝脏转移的胰岛β细胞瘤，没有淋巴转移;而在胰岛启动子调控下同时表达猴病毒40T抗原和L-选择素的转基因鼠可产生特异性向淋巴结转移的胰岛β细胞瘤，且这种转移能被L-选择素蛋白的抗体所阻断［3］，说明L-选择素可协助肿瘤细胞发生淋巴转移。另有研究发现肝癌细胞表面有CD62L的表达，可协助肿瘤细胞与淋巴结黏附，从而可能介导向淋巴道转移。采用单引物扩增法标记的基因芯片技术筛选乳腺原发癌与淋巴结转移癌的差异表达基因，发现CD62L在淋巴结转移癌中表达上调［4，5］。CD62L在肿瘤组织中表达在肿瘤细胞、脉管内癌栓、间质浸润的淋巴细胞;在转移淋巴结主要表达在转移灶肿瘤细胞、脉管内癌栓以及淋巴细胞;在正常肺组织以及无转移淋巴结主要表达在成熟淋巴细胞;CD62L在癌组织中表达高于正常肺组织;转移淋巴结中的表达高于无转移淋巴结表达;CD62L在转移淋巴结中表达与癌组织中的表达相比无差异;CD62L在正常肺组织表达与无转移淋巴结表达无差异;CD62L在癌组织中阳性表达率明显高于正常肺组织;转移淋巴结中的阳性表达率明显高于无转移淋巴结阳性表达率;CD62L在转移淋巴结中表达率与癌组织中的表达率相比无差异;CD62L在正常肺组织表达率与无转移淋巴结表达率无差异;相关分析显示:CD62L的阳性表达水平(即灰度单位)与淋巴结转移、脉管内癌栓、TNM分期之间存在密切相关，与肿瘤体积、细胞分化程度、侵犯肺膜无关;说明CD62L不仅介导正常肺组织间质慢性炎症中淋巴细胞的归巢，而且参与肺癌细胞的淋巴结转移。肿瘤细胞通过上调CD62L表达粘附到内皮细胞表面，进入脉管系统形成癌栓;同时随肿瘤临床分期的增加，血管新生更加明显，管壁的不完整和低压力便利肿瘤细胞进入脉管系统;同时我们试验也观察到表达CD62L的肿瘤细胞分布大多临近血管丰富区域，并且脉管内癌栓的表达呈现强弱不等现象，淋巴结转移灶中表达较强，而肿瘤组织脉管中癌栓表达较弱，推测CD62L的表达水平与其所处的状态密切相关，位于肿瘤组织内的癌栓低表达，便利肿瘤细胞脱离初期与内皮细胞粘附而进入血流;淋巴结中的过表达便利肿瘤细胞与HEV的内皮细胞粘附游出脉管，完成最终的转移。

MadCAM-1是一种未分类的细胞粘附分子，主要表达在HEV的内皮细胞，与相应的受体CD62L结合介导黏膜相关组织的淋巴细胞的归巢。有研究发现炎性肠病患者粘膜下淋巴小结内以及固有层内的高内皮微静脉过表达，而敲除Mad-CAM-1基因的小鼠免疫力低下，甚至于胚胎期死亡［6，7］。在大肠癌研究中发现MadCAM-1的表达降低，而且与肿瘤组织内淋巴细胞的浸润程度密切相关，淋巴结转移率高于无下降组，但与脉管内癌栓以及新生血管密度无明显相关，而且在胃癌研究中未发现MadCAM-1的下降［8，9］。乳腺癌样本中研究发现淋巴结转移患者同时存在肿瘤周围高内皮微静脉样变，而且转移淋巴结副皮质区的HEV内皮高表达MadCAM-1，而且脉管内癌栓发生率明显高于低表达组［10］。因此推测肿瘤细胞借助Mad-CAM-1的趋化作用，粘附表达相应抗体或被表达相应抗体免疫细胞包绕的癌栓，在进入脉管系统和穿出脉管系统等环节发挥作用，完成淋巴结转移。我们的研究显示MadCAM-1主要表达淋巴结滤泡间区的高内皮后微静脉内皮细胞;在癌组织中的高内皮微静脉无表达;转移淋巴结中的阳性表达率高于无转移淋巴结表达率。MadCAM-1的阳性表达水平与淋巴结转移、脉管内癌栓、肿瘤体积存在明显相关，与细胞分化、侵犯肺膜、肿瘤分期无明显相关。说明MadCAM-1在血管内皮表达参与肺癌的淋巴结转移，其与表达受体CD62L的肿瘤细胞或被免疫细胞包绕表达CD62L的癌栓结合，介导脉管内的肿瘤细胞粘附到表达地址素的HEV，穿越血管进入淋巴结，完成转移。同时随肿瘤体积增加，新生血管增多，进入脉管形成癌栓机会增多，在淋巴结形成转移灶的机会增加。

CD62L及其受体MadCAM-1表达在肺癌组织以及转移淋巴结中表达之间存在密切相关;CD62L及其受体MadCAM-1表达在肺癌组织以及无转移淋巴结中表达之间不存在相关。说明两者在肺癌的淋巴结转移过程中其协同作用，可能是肿瘤细胞过表达CD62L的同时，通过某种机制同时上调HEV内皮细胞MadCAM-1的表达，为淋巴结转移奠定分子基础，使淋巴结转移发生几率增加。

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