高效液相色谱法定量分析竹节参中人参皂苷Rg1的含量

刘少静 王 黎 杨 黎彬 王 小宁 杨阳

竹节参为五加科植物竹节参Panax japonicus C.A.Meyer的干燥根茎，以根状茎和肉质根入药，主产于云南、贵州、四川、湖北等省。竹节参主要药理活性成分包括竹节人参皂苷、人参皂苷、三七皂苷，其药理作用和临床应用已引起研究者的普遍关注［1，2］。目前国内外人参皂苷的测定方法主要有比色法、薄层光密度法、高效液相色谱法、液质联用法等。经比较，高效液相色谱法具有灵敏度高、准确可靠、较易推广等优点［3，4］。为此，该研究建立了以人参皂苷Rg1为质控指标，采用RP-HPLC定量分析竹节参中人参皂苷Rg1的含量，为评价竹节参质量及进一步研究提供一定依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-6AD系统高效液相色谱仪(日本岛津公司);FA1004B电子天平(0.1 mg，上海越平科学仪器有限公司);KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);L-550台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)

1.2 试药 人参皂苷Rg1对照品(中国药品生物制品检定所提供，纯度:98%);乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司);水为超纯水，其他试剂均为分析纯。竹节参药材(由西安医学院生药教研室冯永辉副教授鉴定)。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，置量瓶中，用乙腈溶解并定容，制得浓度为1 000 μg/ml的对照品母液。精密吸取一定量母液，加乙腈定容配制成浓度分别为 500、400、250、100、50、25 μg/ml的系列对照品溶液，4℃冷藏备用。

1.3.2 供试品溶液的制备:精密称取粉碎后过40目筛的竹节参药材粉末0.1 g，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇适量，室温下超声提取60 min，抽滤，收集滤液，于水浴蒸干，残渣用乙腈溶解并定容至25 ml量瓶中。4 000 r/min离心5 min，取上清液过膜，既得供试品溶液。

1.3.3 色谱条件:色谱柱:Venusil ABS C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相采用乙腈:水溶液=21∶79;检测波长:203 nm;柱温:25℃;流速:1.0 ml/min;进样量:10 μl。见图 1。

图1 人参皂苷Rg1及竹节参样品HPLC图A:对照品;B:供试品;1:人参皂苷Rg1

2 结果

2.1 线性关系考察 精密吸取系列对照品溶液各10 μl，按照“1.3.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以进样浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程。见表1。

表1 线性关系实验结果 n=6

2.2 精密度试验 精密吸取250 μg/ml对照品溶液10 μl，按照“1.3.3”项下色谱条件，连续进样5次，测得人参皂苷Rg1峰面积的RSD为1.26%，结果表明，该方法精密度良好。

2.3 重复性试验 精 密称取同一批样品5份，各0.1 g，按照“1.3.2”项下方法制备供试品溶液 5 份，按照“1.3.3”项下色谱条件，分别进样10 μl，测得人参皂苷 R g1峰面积的 R SD为2.31%，结果表明，该方法重复性良好。

2.4 稳定性试验 精 密吸取同一供试品溶液10 μl，分别于0、2、4、6、8、10、12 h 进样，测定峰面积，结果人参皂苷 R g1 峰面积的RSD为1.83%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5 加样回收率试验 精 密称取已知含量的竹节参样品粉末5份，每份约0.05 g，分别加入人参皂苷Rg1对照品适量，依法制成供试品溶液，按照“1.3.3”项下色谱条件，进样分析。测得人参皂苷Rg1加样回收率的平均值及RSD。见表2。

2.6 样品含量测定 精 密吸取竹节参供试品溶液10 μl，按照“1.3.3”项下色谱条件测定。见表3。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 通过实验比较乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸盐缓冲液、甲醇-磷酸盐缓冲液为流动相对供试品进行分离，结果表明乙腈-水分离效果及峰形均较好。人参皂苷Rg1对乙腈十分敏感，为避免样品中杂质的干扰，经反复试验，确定乙腈-水最佳配比为21∶79。

表2 加样回收率实验结果n=5

表3 竹节参中人参皂苷Rg1含量测定结果

3.2 提取工艺的优化 以人参皂苷Rg1的提取率为指标，综合考察提取溶剂、溶剂用量、溶剂浓度、超声时间、超声温度等因素对试验结果的影响，结果发现以15倍量的50%甲醇室温下超声60 min即可基本提取完全。

本研究采用RP-HPLC检测法，结合乙腈-水溶液洗脱，可准确、快速定量测定竹节参中人参皂苷Rg1的含量，为竹节参提供了质量控制依据。结果人参皂苷Rg1含量为65.98 mg/g。

1 李露，程薇，杨洁.高效液相色谱法测定竹节参中多种人参皂苷含量.分析测试技术与仪器，2008，14:19-22.

2 尹文仲，童学飞，陈科力.不同海拔条件下竹节参中人参皂苷含量的比较.湖北民族学院学报·医学版，2006，23:12-14.

3 郝桂彤，李红艳，韩振爽.高效液相色谱法测定定风止痛片中人参皂苷 R g1 的含量.天津药学，2011，23:22-24.

4 贾桂艳，马莉，韩峰.HPLC法测定舒脑心胶囊中人参皂苷Rg1.天津中医药大学学报，2011，30:41-42.