橘子果肉中橙皮苷的提取及含量测定

王尉，乐胜锋，王覃，2，赵新颖，3，张经华

（1.北京市理化分析测试中心，北京 100089；2.北京化工大学，北京100029；3.北京理工大学，北京 100081）

橘子果肉中橙皮苷的提取及含量测定

王尉1，乐胜锋1，王覃1，2，赵新颖1，3，张经华1

（1.北京市理化分析测试中心，北京 100089；2.北京化工大学，北京100029；3.北京理工大学，北京 100081）

采用索氏提取的方法对橘子果肉中橙皮苷进行提取，对提取溶剂、提取温度、提取时间、料液比进行单因素试验，并在该基础上采用正交试验对提取工艺条件进行优化。结果表明：橙皮苷最佳的索氏提取工艺为甲醇作溶剂提取、提取温度85℃、提取时间3h、料液比1∶120，橘子果肉中橙皮苷的含量为2.21mg/g（鲜重）。该方法准确，可靠，可用于橘子中功效成分合理开发和质量控制。

橘子；橙皮苷；索氏提取；高效液相色谱

0 引言

通过研究发现柑橘属植物中含有丰富的黄酮类化合物，其中有文献报道[1]橙皮苷是该植物中重要的活性成分，具有清除氧自由基[2]、抗肿瘤[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、降低血脂、保护心血管[6]等多种功效。

橙皮苷一直是天然食用添加剂和保健食品的活性成分，常被选为指标成分而用于定性和定量分析。目前橙皮苷的检测主要针对枳实[7]、陈皮[8]等样品，并没有橘子果肉中含量测定的研究报道。因此，本文选取橘子的果肉为研究对象，通过提取方法的优化，采用HPLC测定了橙皮苷的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橘子（市售，北京）；橙皮苷（标准品），北京市理化分析测试中心研制，纯度98.38%；甲醇（色谱纯），美国Fisher Scientific公司；水（双蒸水），实验室自制；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（配SPD-M20A检测器）（日本Shimadzu公司）；ALPHA 1～2 plus冷冻干燥机（德国CHRIST公司）；CR22GⅢ离心机（日本Hitachi公司）。

1.3方法

1.3.1 样品的预处理

橘子去皮，称取一定量橘子果肉，榨汁，离心。上清液定容；沉淀部分冷冻干燥，粉碎，备用。

1.3.2 橙皮苷提取的优化

对沉淀部分的索氏提取条件进行优化，首先比较不同提取溶剂对橙皮苷的提取率，即提取所得橙皮苷的质量占沉淀部分干重的比例；再对提取温度、提取时间、料液比进行正交试验，通过方差分析，优选橙皮苷最佳的提取工艺参数。

1.3.3 标准品溶液配制

称取橙皮苷标准品5mg置于25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得0.2mg/mL橙皮苷溶液。再从其中分别吸取8，6，4，2mL置于4个10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，则浓度依次为0.16，0.12，0.08，0.04mg/mL的橙皮苷溶液。

1.3.4 橘子果肉中橙皮苷的测定方法

色谱柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm×5μm）；流动相：0.2%磷酸溶液（A）-甲醇（B），线性梯度洗脱，20%B～80%B（0～30min），80%B（30～40min）；流速：1mL/min；检测波长：284nm；柱温：30℃。分别测定上清液和沉淀部分提取液的橙皮苷含量，计算加和后即为橘子果肉中橙皮苷的总含量。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的确定

分别采用60%、80%、100%的甲醇和乙醇对橙皮苷进行索氏提取，提取温度80℃、提取时间2h、料液比1∶100。不同溶剂提取效果见表1，其中100%甲醇的提取量最高，更有利于橘子果肉中橙皮苷的溶出。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对提取率的影响

橙皮苷在常温下微溶于甲醇，温度升高有利于橙皮苷的提取。图1表明，温度升高橙皮苷溶解度随之增加，当温度达85℃时提取率最高，但温度达到90℃时提取率呈下降的趋势，这可能是由于过高的温度导致其他杂质的溶出，从而抑制了橙皮苷的提取，因此确定提取温度为85℃。

表1 不同溶剂的提取效果

2.2.2 提取时间对提取率的影响

索氏提取的提取时间与回流次数呈正相关，由图2可知，提取时间超过3h后提取率则呈现下降趋势，原因可能是提取时间过长导致橙皮苷的结构变化，故本实验选取3h为最佳提取时间。

2.2.3 料液比对提取率的影响

从图3看出，在料液比达到1∶100之前，提取率随提取液用量的增加而增加，当料液比继续增大时，提取率基本保持不变，这主要是由于索氏提取每次回流提取过程均为新鲜溶剂，过量的溶剂对橙皮苷溶出没有明显作用。

2.3 正交试验

根据单因素试验的结果，以甲醇为提取溶剂，选取提取温度、提取时间和料液比3个因素（见表2），采用正交试验，寻找最佳的提取条件组合，结果见表3。

由表2分析可知，影响橙皮苷提取率的主次因素顺序为ABC，最佳工艺条件为A2B2C3，即提取温度85℃，提取时间3h，料液比1∶120。在该提取条件下，测得橘子果肉中橙皮苷的提取率为2.47%。同时，对提取后的样品进行第2次提取，未检测到橙皮苷成分，说明采用最佳工艺条件通过一次提取即可将橙皮苷提取完全。

2.4 线性范围、检出限与加标回收率试验

将浓度为0.16，0.12，0.08，0.04mg/mL的标准品溶液分别进行HPLC分析，以进样量（mg/mL）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=9170185x+4621，r2=0.9999。结果表明，橙皮苷样品在0.04～0.16mg/mL范围内线性关系良好。同时，测定得到橙皮苷的最低检出限（S/N=3）为0.16μg/L。

图1 提取温度对提取率的影响

图2 提取时间对提取率的影响

图3 料液比对提取率的影响

表2 正交试验因素水平表

表3 橙皮苷提取率的正交试验结果及极差分析

对已知含量的同一样品分别添加3种不同质量浓度的橙皮苷标准品，每个浓度水平样品重复6次，按照2.3所得最优工艺条件进行提取，并进行橙皮苷含量测定，计算加标回收率（见表4）。结果表明，3种水平的加标回收率均大于95.0%，说明本法较准确，适合该样品的含量测定。

表4 橙皮苷的加标回收率（n=6）

2.5 样品含量测定

按照最佳工艺平行提取6个样品，分别测定上清液和沉淀部分提取液的橙皮苷含量（见图4），计算加和后即为橘子果肉中橙皮苷的总含量（见表5）。

3 结束语

采用离心固液分离、冷冻干燥的方法处理橘子果肉样品，并根据正交试验得出了橙皮苷提取的最佳工艺，即提取温度85℃，提取时间3h，料液比1∶120。本研究建立的橙皮苷HPLC分析方法，快速、准确。同时，结果表明，橘子果肉中含有较高的橙皮苷，其含量为2.21mg/g（鲜重），为橘子果肉的保健食品开发和应用提供了参考。

图4 橙皮苷HPLC色谱图

表5 果肉中橙皮苷含量

[1]赵雪梅，朱大元，叶兴乾，等.柑桔属中类黄酮的研究进展[J].天然产物研究与开发，2005，14（1）：89-92.

[2]陈平，樊瑞胜，聂芊，等.橙皮苷磺酸钠对自由基清除能力的研究[J].食品科技，2007，28（9）：64-69.

[3]Amirhosein A，Seyed J H，Farshad N，et al.Chemoprotective effects of Hesperidin against genotoxicity Induced by cyclophosphamide in mice bonemarrow Cells[J]. Archives and Pharmacal Research，2008，31（6）：794-797.

[4]Matook S M，Toshihiko S.Antioxidant and antimicrobial activities of the methanol extracts from pummelo（Citrus grandis Osbeck）fruit albedo tissues[J].European Food Research Technology，2006，224（1）：39-47.

[5]Shailja S，Bhawna A，Stuti B，et al.Antioxidant,antiinflammatory and analgesic potential of the Citrus decumana L.peel extract[J].Inflammopharmacology，2009，17（5）：267-274.

[6]Masaki Y，Atsushi S，Hiroko J，et al.Glucosyl hesperidin prevents endothelial dysfunction and oxidative stress in spontaneously hypertensive rats[J].Nutrition，2008，24（5）：470-476.

[7]童荣生，孙世明，吴齐贤.RP-HPLC测定枳实中橙皮苷的含量[J].华西药学杂志，2000，15（6）：454-455.

[8]孙冬梅，毕晓黎，胥爱丽，等.HPLC测定陈皮提取物及制剂中橙皮苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（11）：1-3.

Extraction and determ ination of hesperidin in orange pulp

WANG Wei1，LE Sheng-feng1，WANG Tan1，2，ZHAO Xin-ying1，3，ZHANG Jing-hua1
（1.Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis，Beijing 100089，China；
2.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；
3.Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Soxhlet extration was applied to extract hesperidin from orange pulps.The effects of reagent，temperature，time，and material-liquid ratio on the extraction yield of hesperidin were investigated，and the extraction process conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments.The optimum process conditions were：extract temperature 85℃，extract time 3.5 h，material-liquid ratio 1∶120 with methanol.The analytical result showed that the content of hesperidin in orange pulp was 2.21mg/g（fresh weight）.The method is accurate and reliable，and may be used for the development of functional components and the quality control of orange.

orange；hesperidin；soxhlet extration；high performance liquid chromatography（HPLC）

S666.2；O629.13；O657.7+2；TS207.3

A

1674-5124（2013）03-0051-03

2012-10-26；

：2012-12-19

国家质检总局公益性行业科研发展专项（201210209）北京市市级财政专项（PXM2012_178305_000006）

王尉（1984-），男，北京市人，助理研究员，硕士，研究方向为天然产物分离纯化。