曲安奈德鼻喷雾剂对鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞及其趋化因子-2 表达的影响

刘新彦，霍占江，牛敬莲，王 晖，刘晓燕，张廷录

鼻息肉是在多种因素共同作用下鼻粘膜的慢性炎症病变，病理表现为以嗜酸性粒细胞(EOS)为主的多种炎细胞浸润［1］。嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)是EOS 特异性趋化因子，通过与EOS上的CC 家族趋化因子受体3(CCR3)特异性结合，促进EOS 在气道聚集及原位激活，从而引起气道病变发生。有研究证实，鼻腔局部应用糖皮质激素能直接抑制鼻粘膜EOS 的活化，抑制鼻息肉生长，防止息肉术后复发的作用［2］。本文旨在研究鼻喷激素对鼻息肉组织中EOS 浸润情况及Eotaxin-2 mRNA 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选择2011 年2 -8 月拟在我院接受鼻内镜手术的鼻息肉患者24 例，随机分成激素治疗组和未治疗组，每组12 例。激素治疗组(男7例，女5 例，平均年龄38.14 岁)应用曲安奈德鼻喷雾剂喷鼻治疗6 ～8 周(110 μg/次，1 次/d)。未治疗组(男6 例，女6 例，平均年龄42.53 岁)未采取任何治疗措施，只随访观察。所有患者治疗及观察结束后，均于全麻下行经鼻内镜鼻息肉摘除术，所有标本手术切除后分为2 份:1 份立即置于-196 ℃液氮冷冻后，置于-70 ℃冰箱中冰冻保存备用;1 份制作石蜡标本，并由2 位有经验的病理医师阅片，证实诊断。

1.2 方法 采用RT-PCR 方法分别检测两组鼻息肉组织中Eotaxin-2 mRNA 的表达水平。

1.2.1 引物设计与合成 参照GenBank 公布的Eotaxin-2 及β-actin 基因全长cDNA 序列的资料，借助于计算机软件Primer Premier 5.0、Oligo 6.5各设计了2 条引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。Eotaxin-2 正向引物:5p GGAGTGGGTCCAGAGGTACATTA 3p，反向引物:5p GCAGGTGGTTTGGTTGC 3p，扩增124 bp;内参照β-actin 正向引物:5p ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3p，反向引物:5p CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3p，扩增318 bp。

1.2.2 组织总RNA 的提取 取鼻息肉冰冻标本每组约50 mg，分别加TRIZOL 1 mL，4 ℃匀浆，摇匀，放置5 min。将各组消化好的组织裂解液吸到DEPC 处理过的1.5 mL离心管中，加新开的氯仿0.2 mL，轻摇15 s。室温静置2 ～3 min 后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。然后取上清无色水相(约0.6 mL)到离心管(DEPC 处理过)，加等体积异丙醇，室温下静置10 min。4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。观察总RNA 在管底的白色沉淀，弃去上清，75%乙醇1.0 mL 洗涤(用DEPC 水新配制)后，4 ℃、7 500 r/min离心5 min。去上清，用小Tip吸干液体。气干沉淀5 ～10 min，DEPC 处理水20 ～30 μL加入，中枪打匀，55 ～60 ℃水浴10 min溶解总RNA，测光密度值。电泳:制备10 g/L琼脂糖凝胶(Agarose gel，AG)，取5 μL PCR 扩增产物，加1 μL 上样缓冲液混匀，加样于凝胶载样孔中，按5 ～10 V/cm 电压梯度电泳25 ～30 min 后在紫外透射仪下观察结果并照相记录。

1.2.3 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 参照Fermentas 反转录试剂盒说明书进行实验，反转录为cDNA。分别以不同患者鼻息肉组织cDNA 为模板，扩增Eotaxin-2 基因灰度扫描测定吸光度值。同样反应条件下，扩增β-actin 作为阴性对照，计算相对吸光度。

1.3 统计分析 应用SPSS 13.0 软件进行统计分析，计量资料以±s 表示，采用配对t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组鼻息肉组织中Eotaxin-2 mRNA 表达水平 以β-actin 为参照，β-actin 条带位于318 bp处，两组均于124 bp 处出现特异性Eotaxin-2 基因条带，灰度扫描测定吸光度，激素治疗组Eotaxin-2 mRNA 吸光度值为(0.83 ± 0.09)，未治疗组为(2.41 ±0.35)，激素治疗组Eotaxin-2 mRNA 明显低于未治疗组(P ＜0.01)。见图1。

图1 Eotaxin-2 mRNA RT-PCR 产物电泳图

2.2 HE 片中EOS 数量结果判定 HE 染色切片光镜下观察EOS，其胞浆染为粉红色，细胞多呈圆形，体积较大，深蓝色分叶或肾形双核，在250 倍视野下每例标本选取5 个视野，计数EOS 细胞数，按EOS 细胞所占的百分率分为- ～+ + + (-:EOS 细胞≤5%;+:EOS 细胞占6% ～30%;+ +:EOS 细胞占31% ～50%;+ + +:EOS 细胞＞50%)。见表1，图2、图3。

表1 激素治疗组与未治疗组嗜酸粒细胞浸润情况(例，%)

图2 未治疗组鼻息肉组织中EOS 浸润情况(HE 染色×200)

图3 治疗组鼻息肉组织中EOS 浸润情况(HE 染色×200)

3 讨论

鼻息肉组织光镜下表现为大量炎细胞浸润，以EOS 为主，主要位于粘膜下、小血管周围。武宇宏［3］在透射电镜下观察发现，鼻息肉组织存在大量活化期EOS，表现为包膜不完整且胞浆皱折增多，伸出伪足，伪足内可见颗粒或空泡，而对照组EOS 明显减少，且均为静息态EOS。鼻息肉中EOS 增多是Eotaxin 的趋化作用使EOS 发生选择性聚集的结果。Eotaxin 是EOS 的高选择性趋化因子，现已发现的成员有Eotaxin-1、Eotaxin-2、Eotaxin-3。其中，Eotaxin-2 是最主要的趋化因子，特异性趋化EOS，促使其向局部浸润并激活。Schaefer 等［4］发现，Eotaxin-2 主要存在于鼻腔粘膜内皮细胞和上皮细胞，表明Eotaxin-2 从粘膜内侧迁移到上皮层，引起EOS 为主的炎性反应疾病。Eotaxin-2 对鼻息肉的形成起着很重要的作用。

糖皮质激素鼻喷剂辅助治疗鼻息肉已广泛应用于临床，并取得一定疗效。2007 年欧洲鼻窦炎/鼻息肉诊疗指南将鼻喷激素作为治疗鼻息肉的A类推荐［5］。王成硕等［6］对鼻息肉患者采用经鼻雾化吸入布地奈德混悬液1 周，视觉模拟评分发现，鼻塞、流涕、嗅觉丧失、头痛症状均明显减轻，鼻内镜下见息肉体积明显减小，且对肾上腺皮质功能无明显影响［7］，提示短疗程鼻雾化吸入激素治疗鼻息肉安全有效。杨武等［8］采用免疫组化方法发现，全身应用激素后，鼻息肉组织中Eotaxin 表达显著降低，表明糖皮质激素抑制Eotaxin 蛋白的表达，减少EOS 募集和活化。任秀敏等［9］研究发现，鼻息肉患者应用布地奈德鼻喷雾剂喷鼻治疗4 ～6周后，Eotaxin 蛋白在鼻息肉组织中表达显著降低。本研究结果表明，患者应用曲安奈德鼻喷雾剂治疗6 ～8 周后，鼻息肉较前明显减小，鼻堵症状缓解，鼻粘膜水肿减轻，嗅觉改善，术后病理切片显示，EOS 浸润较治疗前明显减少，且Eotaxin-2 mRNA 的表达明显下调，与上述研究结果一致。表明鼻喷激素使鼻息肉组织中Eotaxin-2 蛋白的表达减少，进而减少了嗜酸粒细胞聚集和活化，使鼻息肉组织中的EOS 炎症反应程度降低，提示阻止炎型递质可能是治疗鼻息肉的一种新思路。有关糖皮质激素具体抑制Eotaxin 蛋白表达的机制还需进一步研究。

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［6］ 王成硕，娄鸿飞，娄玮，等.短期布地奈德混悬液经鼻雾化治疗慢性鼻窦炎伴鼻息肉的疗效和安全性研究［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2012，26(8):347-350.

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［8］ 杨武，施唯，陈金辉，等. 全身应用激素对鼻息肉组织中Eotaxin 表达的影响［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，21(2):79-81.

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