结核分枝杆菌T细胞斑点实验在肺结核诊断中的应用

孙海柏，张 立，刘佳庆，杜岩青，曹 宏

(天津市海河医院，天津300350)

在肺结核的实验室诊断中，结核菌培养可以作为确诊肺结核的主要依据，但是检测时间长，容易延误病情，并且针对不同类型的肺结核来讲结核菌培养并非全部适用，容易漏诊。近年来，一种以T细胞为基础的体外γ-干扰素释放试验及结核分枝杆菌T细胞斑点试验(T-SPOT．TB)得到了较快的发展，在欧美国家已经成为结核病临床常规检测方法之一［1］。目前临床上应用的结核病实验室诊断方法包括痰涂片结核杆菌检测、T-SPOT．TB、结核菌核酸检测(TB-DNA)、抗结核抗体检测4种，我们对这4种方法在诊断肺结核中的敏感性及特异性作了对比分析，探讨肺结核快速、准确的诊断方法。

1 资料与方法

1．1 临床资料 2010年4月～2013年4月在天津市海河医院接受肺结核筛查的病例共1 673例。肺结核组1 171例，男879例，女292例;年龄18～84岁;根据临床表现、病史、X线胸片检查结果以及结核菌培养结果作出诊断;依据《结核病诊治指南》中的诊断标准分为原发性肺结核96例，血型播散型肺结核262例，继发性肺结核487例，结核性胸膜炎326例;跟据痰涂片结核杆菌检测结果分为痰涂片阴性肺结核241例，痰涂片阳性肺结核930例。非肺结核组502例，男325例，女177例;年龄28～78岁;根据临床表现、病史、X线胸片检查结果以及结核菌培养结果等排除肺结核，并进行2个月跟踪随访未出现结核病相关临床症状。

1．2 痰涂片结核杆菌检测、T-SPOT．TB、TB-DNA、抗结核抗体检测方法 ①痰涂片结核杆菌检测:痰涂片镜检采用萋—尼抗酸染色法，第1次镜检阴性痰标本重复第2、3次留痰检查。胸腹水等非痰标本离心后取沉渣涂片镜检。结核杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈蓝色。②T-SPOT．TB:试剂盒来自英国Oxford Immunotec Limited公司。按照说明书进行操作，根据抗原A和(或)抗原B孔的反应判断结果:a．对照孔斑点数为0～5个，样本斑点数(抗原A孔或抗原B孔的斑点数)－对照孔斑点数≥6个判断为阳性;b．对照孔斑点数≥6个，样本斑点数(抗原A孔或抗原B孔的斑点数)≥2倍对照孔斑点数判断为阳性。③TB-DNA:采用实时荧光PCR法。DNA的提取按照试剂盒说明书进行操作。结果判定:按照试剂盒说明书，如果Ct值=30，则实验结果为阴性;如果Ct值＜30，则实验结果为阳性。④抗结核抗体检测:抗结核抗体检测试剂盒购于北京华医杏林医疗技术有限公司代理的英国OMEGA诊断试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪读取光密度值(OD值)，在标准滴度曲线表中查找，得出相应标本中抗结核抗体滴度，＞400 U/mL为阳性。

1．3 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件。率的比较用χ2检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 4种检测方法的检测结果 详见表1。

表1 两组受检对象四种检测方法的检测结果(例)

表2 4种检测方法诊断肺结核的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及约登指数

2．3 4种检测方法诊断不同类型肺结核的阳性率

与其他3种方法相比，T-SPOT．TB诊断各型肺结核的阳性率最高(P均＜0．05)。详见表3。

表3 4种检测方法诊断不同类型肺结核的阳性率(%)

2．4 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗结核抗体检测对痰涂片阴性与痰涂片阳肺结核的诊断结果 T-SPOT．TB诊断痰涂片阴性与痰涂片阳性肺结核的阳性率明显高于其他两种检测方法(P均＜0．05)，但T-SPOT．TB诊断痰涂片阴性与痰涂片阳性肺结核的阳性率相近 (P＞0．05)。详见表4。

表4 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗结核抗体检测对痰涂片阴性与痰涂片阳性肺结核的诊断结果

2．5 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗结核抗体检测诊断痰涂片阴性肺结核的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值 T-SPOT．TB诊断痰涂片阴性肺结核的灵敏性明显高于其他两种检测方法(P均＜0．05)，但特异性不高。详见表5。

表5 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗结核抗体检测诊断痰涂片阴性肺结核的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值(%)

3 讨论

传统的痰涂片检测结核杆菌阳性率较低，特别在含菌量少的情况下，而且无法区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。抗结核抗体作为快速诊断肺结核的参考指标之一，其敏感性低，特异性不高，检测结果容易受到卡介苗接种的影响。本研究中肺结核患者抗结核抗体阳性率仅为52%。TB-DNA检测诊断肺结核有其独特的优势［2］，本研究发现，其诊断不同类型肺结核虽有较好的特异性，但灵敏性、阴性预测值、约登指数较低。

T-SPOT．TB检测原理:①在结核分枝杆菌中存在RD1基因序列，而在卡介苗菌株和绝大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏该序列［3］。RD1编码产生两种蛋白，即ESAT-6和CFP-10，其作为特异性抗原刺激机体T淋巴细胞成为致敏T淋巴细胞，后者产生细胞因子IFN-γ。②T-SPOT．TB是一种酶免疫技术，从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞，每1个显色斑点代表1个结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞。根据斑点数可以判断体内是否存在针对结核分枝杆菌反应的效应T淋巴细胞，并可计数T淋巴细胞的数量。此方法能从60 000个分泌IFN-γ的细胞中测出1个细胞，不受卡介苗接种的影响，交叉反应少，特异性很高。本研究发现，针对不同种类的肺结核，T-SPOT．TB都有较高的敏感性和特异性。

原发性肺结核以儿童发病为主，儿童吐痰比较困难，所以痰涂片和痰TB-DNA检测都不能发挥很好的作用，抗结核抗体检测的阳性率仅为24．6%，而T-SPOT．TB检测的阳性率达76．45%，且敏感性较高，T-SPOT．TB可以协助诊断儿童结核病及对抗结核药物治疗效果进行评估［4，5］。由于效应T淋巴细胞在外周血中的寿命比较短，故该方法还能判断药物治疗后患者体内是否清除了结核菌［6］。

结核病内源性复发是继发性肺结核的主要发病原因，结核病外源性再感染是指曾感染过结核菌，这类人群痰涂片的敏感性是24．01%，抗结核抗体的阳性率达 70．8%，TB-DNA 阳性率为 54．1%，而T-SPOT．TB的阳性率达91．2%。T-SPOT．TB 诊断血行播散性肺结核的敏感性达87%，而其他3种检测方法的阳性率都不是很高。结核性胸膜炎患者胸水涂片检测结核菌阳性率较低，胸水抗结核抗体检测阳性率为 39．6%，TB-DNA 阳性率仅为 27．5%，而T-SPOT．TB诊断结核性胸膜炎的阳性率达69．94%，较有诊断意义，同时有相关文献［7，8］报道其还能协助鉴别结核性及非结核性胸膜炎。在4种检测方法中，T-SPOT．TB诊断痰涂片阴性肺结核的敏感性最高，但其特异性较低，所以区分痰涂片阳性肺结核和痰涂片阴性肺结核，要同时结合患者的临床表现、病史、X线胸片检查进行诊断。

综上所述，4种检测方法中T-SPOT．TB诊断各类肺结核敏感性最高，能在48 h之内出结果，比传统的结核菌培养有很大优势，用于初发疑似肺结核的筛查诊断效果优于传统的检测手段。

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