盐酸法舒地尔预处理联合缺血后处理对离体大鼠心肌缺血/再灌注的影响

关月娥 ，贾大林，吴 楠，舒雯琪，陈宝君，王 媛

(中国医科大学附属第一医院，沈阳110001)

心肌缺血后尽早对缺血区进行血液再灌注是阻止心肌细胞死亡的惟一有效方法。然而，再灌注本身会加重并扩大缺血后心肌细胞损伤，即发生再灌注损伤。研究［1］表明，缺血后处理，即心肌缺血后在经历长时间再灌注之前进行的反复、短暂的再灌注/缺血循环，可明显减轻心肌再灌注损伤。缺血后处理的心肌保护作用已经在多种实验动物甚至人类身上得到了证实［2～4］。Rho激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究［5］发现，Rho激酶参与了多种心脏的病变过程。近来还发现Rho激酶在缺血心肌中被异常激活，这可能与缺血引起的心肌损伤密切相关［6］。研究［7］表明，Rho激酶抑制剂法舒地尔对缺血性心脏疾病有治疗作用。也有研究［8］证实，法舒地尔能发挥类似缺血预处理样的心脏保护作用。2012年10月1日～2013年3月1日，我们采用大鼠离体心脏缺血/再灌注模型，观察法舒地尔预处理联合缺血后处理对离体大鼠心肌缺血/再灌注的影响，初步探讨其可能的心肌保护机制。

1 材料与方法

1．1 动物 健康雄性 Wistar大鼠60只，体质量250～300 g，由中国医科大学实验动物部提供。

1．2 药品与试剂 盐酸法舒地尔注射液(30 mg/2 mL，天津红日药业股份有限公司);氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司，美国);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程公司)。

1．3 大鼠离体心脏Langendorff灌流模型制备 大鼠以10%水合氯醛行腹腔麻醉，固定后以3 mg/kg肝素钠经腹腔注射，充分肝素化后迅速开胸，取出心脏，置KH液(4℃)中修剪，迅速悬挂于Langendorff灌流系统上，整个过程在2 min内。灌流温度维持在37℃，KH液以95%的O2和5%的CO2充分饱和灌注。经左心耳剪开左心房，将充水乳胶囊置于左心室内，灌流平衡20 min后开始实验。

1．4 实验动物分组 将60只Wistar大鼠心脏随机分为6组:①对照(Control)组:缺血30 min，再灌注120 min，不使用药物干预。②缺血后处理(IPO)组:缺血30 min，再灌注10 s、缺血10 s，重复6 次，然后再灌注120 min。③小剂量法舒地尔预处理(LF)组:缺血前15 min以含有1μmol/L的法舒地尔KH液灌注，随后缺血30 min，再灌注120 min。④大剂量法舒地尔预处理(HF)组:缺血前15 min以含有10μmol/L的法舒地尔 KH液灌注，随后缺血30 min，再灌注120 min。⑤小剂量法舒地尔预处理联合缺血后处理(LF+IPO)组:缺血前15 min以含有1μmol/L的法舒地尔KH液灌注，缺血30 min，予6次10 s的再灌注/缺血循环，随后再灌注120 min。⑥大剂量法舒地尔预处理联合缺血后处理(HF+IPO)组:步骤同 LF+IPO组，法舒地尔剂量为10 μmol/L。

1．5 血流动力学指标测定 采用左心室内水囊传递压力测定心室内压，通过MS2000生物信号采集系统记录左心室各项心功能指标，包括心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室内压最大上升及下降速率(+dp/dtmax，－dp/dtmax)。分别于缺血前(baseline:灌流平衡20 min时)及再灌注10 min(R-10)、30 min(R-30)、120 min(R-120)时采集上述各指标。

1．6 心肌梗死面积测定 心脏灌流结束后，从灌流装置上取下离体心脏，放入－20℃冰箱内冰冻1 h后取出，平行于房室沟方向，自心尖向心底将左室均匀切成等厚度的6片，将切片放入1%的TTC溶液中孵育10 min，随后用10%的甲醛固定15 min，切面非梗死区为红色、梗死区为灰白色。数码相机采集图像，用Image J图像分析软件分析计算心肌梗死面积，结果以此计算面积占整个心脏心肌面积的百分比表示。

1．7 SOD、MDA测定 各组选择再灌注末时点作为观察点，分别收集1 mL冠状动脉(冠脉)流出液，用分光光度计及相应试剂盒测定SOD、MDA的水平。

1．8 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件。计量资料以¯x±s表示，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，若存在统计学意义，则进一步行组间两两比较(SNK法)。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组大鼠离体心脏左室心功能指标比较 与Control组相比，IPO、HF、LF+IPO、HF+IPO 组的HR、LVDP、±dp/dtmax明显升高(P 均 ＜0．05)。与IPO、HF组相比，HF+IPO 组的 HR、LVDP、±dp/dtmax明显升高(P均＜0．05)。详见表1。

2．2 各组大鼠离体心脏心肌梗死面积比较 Control、IPO、LF、HF、LF+IPO、HF+IPO 组心肌梗死面积分别为 45．6% ± 6．5%、34．8% ± 4．1%、43．5%±4．2%、32．1% ±3．7%、35．6% ±3．3%、24．2% ±

表1 再灌注过程中各组大鼠心脏HR、LVDP、+dp/dtmax、－dp/dtmax比较(¯x±s)

2．8%。IPO、HF、LF+IPO、HF+IPO 组与 Control组相比，P均＜0．01;HF+IPO组与HF、IPO组相比，P均 ＜0．05。

2．3 各组大鼠离体心脏冠脉流出液中SOD活性、MDA水平比较 结果见表2。

表2 大鼠离体心脏冠脉流出液中SOD活性、MDA 水平比较(¯x ±s)

3 讨论

缺血后处理是目前预防心肌缺血/再灌注损伤的主要方法之一［9～11］。有研究发现［12］，部分药物如吸入性麻醉药、腺苷等可以模拟缺血预处理的心肌保护效应，将这一方式称为药物预处理。Rho激酶抑制剂法舒地尔也具有药物预处理效应。本研究结果显示，大剂量(10μmol/L)盐酸法舒地尔预处理联合缺血后处理较单一方法干预能显著缩小心肌梗死范围，改善缺血/再灌注后心功能。提示大剂量法舒地尔预处理和缺血后处理这两种干预措施可能具有协同抗心肌缺血/再灌注损伤的作用。

Demiryürek 等［8］研究证实，小剂量(0．3 mg/kg和1 mg/kg)的法舒地尔预处理对心脏无保护作用，并且会抑制缺血预处理的心肌保护效应。但大剂量(10 mg/kg)盐酸法舒地尔预处理能改善心功能，缩小心肌梗死面积，减少心肌酶的释放，能发挥类似缺血预处理样的心脏保护作用。本研究也证明大剂量(10μmol/L)盐酸法舒地尔预处理对缺血/再灌注心肌具有保护作用，而小剂量(1μmol/L)盐酸法舒地尔预处理对心脏无明显保护作用，并且小剂量(1μmol/L)法舒地尔预处理联合缺血后处理干预较单一方法干预不能额外缩小心肌梗死范围以及改善缺血/再灌注后心功能，进一步证实法舒地尔预处理对心肌保护作用可能存在一定程度的剂量依赖性。

心肌缺血/再灌注损伤发生机制尚未完全明确，目前认为可能与氧化应激、氧自由基、钙超载、炎症介质释放、血管内皮细胞、心肌纤维能量的代谢障碍及细胞凋亡等因素有关。其中再灌注期间急剧增加的氧自由基与细胞膜的脂质发生脂质过氧化反应，从而导致细胞膜破坏是导致心肌缺血/再灌注损伤的中心环节［13］。MDA是脂质过氧化反应的产物，而SOD是清除氧自由基所必需的酶，前者水平的高低反映机体受自由基攻击的严重程度，后者水平的高低反映了机体抗氧化应激损伤的能力。本研究发现，缺血后处理和大剂量盐酸法舒地尔预处理均能显著降低离体心脏冠脉流出液的MDA水平、升高SOD活性;大剂量(10μmol/L)盐酸法舒地尔预处理联合缺血后处理干预较单一方法干预能显著降低MDA水平、升高SOD活性。提示两者可能是通过提高机体抗氧化应激损伤的能力来发挥协同的心肌保护作用。

综上所述，大剂量法舒地尔预处理联合缺血后处理明显缩小缺血/再灌注心肌的梗死范围，改善心功能，说明两者联合应用在缺血/再灌注损伤中对心肌的保护作用起到叠加作用，而这一叠加作用可能是通过提高机体抗氧化应激损伤的能力来实现的。两者联合在临床应用中的效果及其对心肌保护作用的机制还有待进一步研究。

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