电堆积毛细管电泳法检测食品中四环素类抗生素残留

邵钰秀，余云娟，肖晶，陶香香，陈冠华

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

电堆积毛细管电泳法检测食品中四环素类抗生素残留

邵钰秀，余云娟，肖晶，陶香香，陈冠华

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

建立了一种采用电堆积方式在线富集的毛细管电泳检测牛奶、鸡蛋和蜂蜜中（包括四环素、土霉素、强力霉素在内）3种四环素类抗生素残留的方法.对影响富集倍数和分离的主要因素进行了优化.最佳运行缓冲液为20mmol／L的柠檬酸盐溶液，pH为2.5，分离电压20kV；进样量25kV×30s.在优化条件下，四环素、土霉素和强力霉素的富集倍数分别为86，54和54；检出限为1.7～2.1，1.8～2.2和1.9～2.2μg／kg；定量下限均为20μg／kg，仅为欧盟标准中最大残留限量的1／5（牛奶）和1／10（鸡蛋）.方法可应用于鸡蛋、牛奶和蜂蜜中3种四环素类抗生素残留的检测.

四环素类抗生素残留；堆积；毛细管电泳

四环素类抗生素（tetracycline antibiotics，TCs）是由放线菌属产生的一类广谱抗生素，在化学结构上属于氢化并四苯环衍生物，对革兰氏阳性和阴性细菌、立克次氏体等均有抑菌作用，在禽畜生产中被广泛作为治疗药物使用.当其作为饲料添加剂以mg／kg级的亚治疗量应用于动物饲料中时，可以改善动物营养状况，预防疾病，促进动物生长，提高养殖效益［1］.治疗用药后禁药期控制不当或作为添加剂使用不当均可导致该类抗生素在动物性食品中的残留超标.在蜂蜜生产过程中，TCs残留主要是在治疗蜜蜂幼虫腐臭病时施用而产生的［2］.长期食用TCs残留超标的动物性食品等同于服用低剂量的抗生素，会导致耐药菌群的产生，造成严重后果.欧盟、美国和中国等均规定了TCs在动物源食品中的最大残留限量［3］.

已报道的四环素类抗生素残留的检测方法包括高效液相色谱法［4］、微生物法［5］、薄层色谱法［6］和毛细管电泳法（CE）［7］等.在这些方法中，色谱类方法为防止复杂的样品基质对色谱柱的污染，通常需要较为费时的样品净化处理；微生物法的测试周期较长，并且定性较差.CE不需要为防止色谱柱污染而进行的样品净化处理，试剂消耗量极少，分离效率高.在药物或药物代谢样品的检测方面已有一些应用报道［8－10］.然而，由于CE中使用的毛细管极细，样品承载量很小，采用紫外吸收检测时，得到的检出限难以满足食品中药物残留分析的要求，故其在兽药残留检测方面的应用受到限制.迄今，以CE方法检测食品中TCs残留只有少量报道［7，11－12］，都需要辅以固相萃取方法来增强检出能力.

CE在线富集技术是解决其在痕量分析方面不足的一个发展方向.这类技术的一个共同特点是采用大进样量，然后通过对分析物区带的极大压缩而大大提高其在区带中的浓度，进而达到增强检出能力的目的，在农兽药残留分析中已有一些应用［13］.样品堆积是在线富集技术的一种.该方法在毛细管区带电泳的基础上，利用低电导样品中离子组分在高电导背景缓冲液界面上运动速度的突变实现对分析物的富集，尚无采用此法对TCs残留进行检测的报道，本文对利用此技术检测食品中四环素（teracycline，TC）、土霉素（oxytertracycline，OTC）和强力霉素（doxycycline，DC）的残留进行了研究.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CL1020毛细管电泳仪（北京彩陆科学仪器有限公司），配±30kV可调电源、紫外分光光度检测器和HW－2000色谱工作站；未涂层熔融石英毛细管（邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司），75μm i.d.，总长60cm，有效柱长51cm；H－180超高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；BS 124S电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；pHS－2型酸度计（上海第二分析仪器厂）；B5500S－MT超声清洗机（必能信超声（上海）有限公司）.

TC，OTC，DC盐酸盐标准品购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司.柠檬酸、氢氧化钠、盐酸、乙腈、正己烷均为分析纯，购于上海国药化学试剂有限公司.牛奶、鸡蛋和蜂蜜均购于镇江某超市.纯氮（体积分数为99.99%）购于镇江氧气厂.实验用水为去离子水，电阻率182kΩ·m.

1.2 电泳条件

运行缓冲液为20mmol／L柠檬酸盐溶液，用NaOH调pH为2.5.分离电压20kV，电动进样25kV× 30s，分离柱温25℃，检测波长275nm.

新用毛细管开始使用前，分别用甲醇冲洗10min，1mol／L盐酸冲洗10min，1mol／L NaOH冲洗30min，0.1mol／L NaOH冲洗10min，缓冲液冲洗10min，每次之间都用水洗5min.每次开始实验前用1mol／L NaOH、水和运行缓冲液分别冲洗5min，样品间用0.1mol／L NaOH、水和运行缓冲液分别冲洗3min.

1.3 标准和样品溶液制备

精密称取适量TC，OTC，DC于烧杯中，分别用空白牛奶、鸡蛋和蜂蜜的样品溶液溶解并定容，得到3组质量分数为20，100，500，1 000，2 000μg／kg的标准溶液系列.

精密称取10.0g牛奶、鸡蛋样品于50mL离心管中，加入10.0mL水、20mL乙腈混合后超声提取20min，以5 000r／min速度离心10min.取上清液，用5mL水、10mL乙腈重复提取，合并上清液于分液漏斗中，向分液漏斗中加入水饱和的正己烷（牛奶中不用加），振荡摇匀3min，静止后收集水层，将水层在40℃下旋转浓缩至干.用水溶解并定容到1mL.

精密称取10.0g蜂蜜，用温水溶解于烧杯后转移到50mL离心管中，以5 000r／min速度下离心10min，取上清液，在40℃下旋转浓缩至干，用水溶解并定容至1mL.

2 结果与讨论

2.1 电动进样下的堆积过程原理

TCs为两性化合物，在pH＜3.0的条件下为阳离子状态［14］.在电动进样之前，毛细管中充满pH为2.5的运行缓冲液.在正向进样电压作用下，由于毛细管中的电渗流在pH为2.5时十分微小，运行缓冲液在进样电场作用下运动十分缓慢，在进样时间内样品溶液中的溶剂在电渗流作用下只能进入极窄的一个区带.由于样品溶液的电导率要远小于运行缓冲液的电导率，在毛细管中，进样电压的绝大部分将分配在极窄的样品区，这导致样品区的电场强度远大于运行缓冲液区.于是，在正向进样电压作用下，样品溶液中以阳离子形态存在的TC，OTC和DC在高场作用下快速电泳进入毛细管，当其穿越样品和运行缓冲液界面时，由于进入低场区，其运动速度将立即降低，发生分析物离子在样品与缓冲液界面处的堆积，由此实现了对分析物的在线富集.

2.2 分离影响参数的优化

根据堆积过程原理，在适当的进样时间内，分析物电动进入毛细管的区带宽度是很窄的，并且位于毛细管的入口位置处.因此，这种进样方式引入的样品与直接正常压力进样方式引入的样品区带并无显著差别，对分离条件的优化可以按照正常压力进样方式进样后的情况进行.在毛细管区带电泳分离过程中，运行缓冲液的pH、电解质浓度和分离电压是影响分离的主要因素，需对此进行优化.

在进样量为1.46kPa×10s、分离电压20kV和30mmol／L柠檬酸盐的初始条件下，在pH 2.0～7.0内考察了其对分离的影响.当pH≥4.5时，分析物在1h内未出峰，这与TCs在pH 3.5～7.5内为两性离子［14］，表观电泳淌度极小有关；当pH＜2.5时，OTC和DC重叠；在pH 2.5～4.0内，3种分析物可基线分离，但是pH＞3.0，峰开始展宽，且迁移时间大大增加，这与其开始向两性离子过渡有关.pH值对分离的影响如图1所示.综合考虑，在pH 2.5时，峰宽较小且迁移时间较短，峰高最高，此pH值被选定为最佳值.

图1 pH对分离的影响Fig.1 Effect of pH on separation

缓冲液中电解质的浓度直接影响到毛细管壁的Zeta电势，使电渗流发生改变，同时对分析物的纵向扩散产生影响，最终影响到峰高和分离度.在优化pH值下，进一步在15～50mmol／L内考察柠檬酸盐浓度对峰高和分离度的影响，发现在此浓度内3种分析物均能达到基线分离，其中在20mmol／L的时候，峰高最大，故此为最优浓度.

在上述优化的缓冲液和1.46kPa×10s进样量条件下，分别以10，15，17，20，25kV的分离电压对3种分析物进行分离.随着电压的增大，迁移时间减小；但当电压为25kV时，OTC和DC重叠严重；当电压为20kV时，3种分析物能在20min内出峰.综合考虑分析速度和分离度，选择分离电压为20kV.

2.3 进样量的优化

在电动进样条件下，分析物能够通过电泳迁移被引入毛细管，但是在进样电压作用下，被引入的分析物也可以进行彼此间的分离.随着进样时间的不断延长，虽然分析物能够被更多地引入，但在进样阶段持续的分离过程时间也会越长，这等同于分析物分离前的原始区带宽度加大，将导致分离后各分析物的峰宽加大，最终影响各组分的分离.因此，需要对进样量进行优化.在上述优化的分离条件下，考察进样量对峰高的影响，结果如图2所示.从中可以看出，随着进样量A的加大，分析物的峰高h在不断加大；但当进样量超过750kV×s时，3种分析物不能达到基线分离.兼顾峰高和分离度，选择进样量为750kV×s，与此值相应的进样量为25kV×30s.

图2 进样量对峰高的影响Fig.2 Effect of sample size on peak heights

2.4 富集倍数

采用上述优化条件和进样量分离质量浓度为0.2mg／L的3种TCs混合标品，测得各自的峰面积为Si，以同样的分离条件和1.46kPa×1s的进样量，分离质量浓度为50mg／L的3种TCs混合标品，测得各自的峰面积为si，则有富集倍数为fi＝（Si／si）×（50／0.2）.由此可计算出TC，OTC和DC的富集倍数分别为86，54和54倍.

2.5 方法验证

在优化条件下分别测定3种TCs的标准溶液系列（每个点3个平行），得到3种兽药的校正曲线、线性范围和相关系数r；平行测定9个空白样品溶液，按3倍信噪比计算得到检出限；以1mg／L样品溶液平行测定9次，计算精密度RSD；结果见表1.

表1 校正曲线、线性范围和精密度Tab.1 Calibration curves，linear dynamic ranges and precisions

按照优化条件分别测定了市售牛奶、鸡蛋和蜂蜜样品中3种TCs的残留，均未检出；同时对每种样品中每种兽药进行了20，50和100μg／kg水平的加标回收率实验，在每个浓度水平进行6次平行测定，得到的加标回收率如表2所示，标准和加标样品的电泳图如图3所示.

图3 标准溶液（A）和加标样品（B）电泳Fig.3 Electropherograms of standard（A）and spiked sample（B）

表2 加标样品回收率Tab.2 Calibration curves，linear dynamic ranges and precisions

3 结论

本研究建立的方法可以实现对TC，OTC和DC残留的在线富集，富集倍数分别达到86，54和54倍.方法的定量下限仅为欧盟规定TC和OTC在牛奶中的最大残留允许限量的1／5，在鸡蛋中的1／10，而强力霉素在欧盟中规定在泌乳牛和产蛋鸡中是禁止使用的.方法能够用于牛奶、鸡蛋和蜂蜜中这3种抗生素的残留检测.

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（责任编辑：梁俊红）

Analysis of tetracycline antibiotic residues in food by capillary electrophoresis with stacking

SHAO Yuxiu，YU Yunjuan，XlAO Jing，TAO Xiangxiang，CHEN Guanhua
（College of Food and Bioengineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

The method of capillary electrophoresis with stacking was developed to determine the three tetracycline antibiotic residues including tetracycline，oxytetracycline and doxycycline in milk，egg and honey.The important parameters influencing enrichment factors and separation were optimized.The optimal running buffer was 20mmol／L citrate solution at pH 2.5.The separation voltage was 20kV.The sample size was 25kV×30s.Under the optimum conditions，the enrichment factors were 86，54and 54，and the limits of detection were 1.7-2.1μg／kg，1.8-2.2μg／kgand 1.9-2.2μg／kg for tetracycline，oxytetracycline and doxycycline，respectively.The limits of quantification were all 20μg／kg，which was only 1／5（milk）and 1／10（egg）of the maximum residual limits demanded by the regulation of European Union.The method can be applied to determine these three tetracycline antibiotic residues in milk，egg and honey.

tetracycline antibiotic residues；stacking；capillary electrophoresis

O657.8

A

1000－1565（2013）02－0161－06

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.010

2012－12－20

教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20093227110010）；江苏高校优势学科建设工程资助项目第一作者：邵钰秀（1987－），女，江苏昆山人，江苏大学在读硕士研究生.

陈冠华（1956－ ），男，山西万荣人，江苏大学教授，博士生导师，从事食品安全检测研究.E－mail：chengh＠ujs.edu.cn