中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析

谢松，李理想，陈宏健，孙玲玲，柳峰松

（河北大学生命科学学院，河北省无脊椎动物系统学与应用实验室，河北保定 071002）

中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析

谢松，李理想，陈宏健，孙玲玲，柳峰松

（河北大学生命科学学院，河北省无脊椎动物系统学与应用实验室，河北保定 071002）

为了探明中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子表达调控机制，利用DNA步移法克隆了中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子及其上游调控序列，总长1 100bp.分析表明，在基因转录起始位点上游－30～－24bp处有1个TATA box，未发现有CAAT box和GC box.同时，在上游调控区还存在有多个可能影响启动子转录活性的顺式作用元件，如NF－κB，YY1和SP1等转录因子结合位点.这些结果为深入研究中国明对虾卵黄蛋白积累及卵子发生过程奠定了基础.

卵黄蛋白原；DNA步移；启动子；顺式作用元件

卵黄是甲壳动物胚胎发生及早期幼体发育的主要营养物质.胚胎和开口前幼体发育、生长所需的能量和营养完全依赖卵黄.因此，卵黄含量和质量对于早期幼体维持生命是至关重要的.卵黄蛋白（vitellin，Vn）是一种高密度糖脂磷蛋白，是卵黄的主要成分.而卵黄蛋白原（vitellogenin，Vg）是Vn的前体，在肝胰腺或卵巢中合成，被卵母细胞摄取加工而成Vn.

雌性动物卵黄生成期可大量合成Vg，而在其他生活时期和雄性动物体内的Vg含量却很低.但后来人们又发现，雄性动物和幼年动物在人工雌激素或低剂量的类雌激素长期作用下，都能诱导体内Vg的生成［1－2］.因此，通过检测雄性卵生动物体内Vg合成可以评价环境中的内分泌干扰化合物（endocrine－disrupting chemicals，EDCs），也可用于环境内分泌干扰物的筛选及环境毒理、污染调查等研究之中.例如，经济合作与发展组织（OECD）已经将Vg作为环境雌激素化学物理想的暴露标志物［3］.几种环境EDC检测生物的Vg基因结构已经被研究［1］.此外，Lee等（2008）克隆了日本虎斑猛水蚤（Tigriopus japonicus）Vg启动子，发现其启动子区不但含有雌性激素应答元件，还含有1个金属应答元件，可以受到重金属镉的诱导调控.

目前已从多种甲壳动物体内分离到Vn，并进行了生化性质研究.与其他甲壳动物Vn类似，中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）Vn也是一种糖脂磷蛋白.本课题组已经对中国明对虾卵Vg基因的cDNA进行了克隆，实验证实此基因在卵黄发生过程中的雌性对虾肝胰腺和卵巢中特异性表达［4］，但其表达的调控的分子机制尚不清楚.

在产卵季节，中国明对虾能在短短几天之内积累大量卵黄，说明Vg基因上具有1个非常强的启动子，加上Vg基因表达关系到生殖发育等重要调控过程，所以Vg启动子及其信号途径的研究具有重要价值.本实验通过DNA步移的方法克隆Vg基因5′端上游序列，并通过生物信息学方法对其进行分析，从而为探明Vg基因调控机制奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

购自于市场上的健康中国明对虾.

1.1.2 生化试剂

DNA提取试剂盒为北京天根生化公司产品；Tag DNA聚合酶、平末端限制性内切酶（EcoRⅤ，DraⅠ，AfaⅠ，PvuⅡ），pMD18－T载体等购自TaKaRa公司，DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒为北京康为生物科技公司产品，测序工作由南京金斯瑞生物技术公司完成.

1.2 方法

1.2.1 中国明对虾基因组文库的构建

利用DNA提取试剂盒提取明对虾DNA，用质量浓度10g／L的琼脂糖电泳检测DNA的质量.分别用AfaⅠ，DraⅠ，EcoRⅤ和PvuⅡ4种平末端的限制性内切酶消化，然后将消化产物分别与DNA接头（Genome Walker Adaptor，如图1）连接，即为中国明对虾Genome Walker文库.

图1 接头与接头引物Fig.1 Structure of the Genome Walker adaptor and adaptor primers

1.2.2 Vg基因5′上游区的克隆

根据中国明对虾Vg基因cDNA序列（GenBank：DQ354690.1）设计基因特异性反向引物R1和R2，同时根据接头序列设计接头引物AP1和AP2.以Genome Walker文库为模板，AP1和R2为引物进行第1轮PCR，反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃最后延伸10min.然后，将扩增产物稀释30倍作为模板，用引物AP2和R1进行第2轮PCR.第2轮PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃最后延伸10min.最后，把回收片段连接pMD18－T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR筛选阳性克隆后测序.

根据测序结果设计特异引物R3和R4.以DNA文库为模板，以AP1和R3，AP2和R4为引物，进行2轮PCR，然后检测，PCR产物回收，测序.

将这2次测序结果进行拼接，同时设计引物R5.以DNA文库为模板，以AP1和R4，AP2和R5为引物进行PCR.DNA回收，测序.

将这3次测序结果进行拼接，同时设计引物F1和R6，以中国明对虾DNA为模板进行克隆验证，克隆产物回收，测序.实验中所用引物见表1.

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

1.2.3 Vg基因启动子及上游调控元件分析

对获得的中国明对虾Vg基因上游序列进行分析.利用网站http：／／www.fruitfly.org／seq＿tools／promoter.html上的NNPP程序和http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic＝tssg＆group＝programs＆subgroup＝promoter的TSSG程序进行转录起始位点以及核心启动子位置预测.同时，综合利用网站http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic＝nsite＆group＝programs＆subgroup＝promoter的在线程序Softberry和http：／／www.gene－regulation.com／cgi－bin／pub／programs／match／bin／files.cgi网站中的AliBaba 2.1，Match以及http：／／www.dna.affrc.go.jp／PLACE／signalup.html的SignalScan程序进行上游顺式调控元件序列分析.

2 结果与分析

2.1 基因上游区序列克隆

根据中国明对虾Vg基因cDNA序列设计反向引物，以Genome Walker文库为模板，利用反向引物和接头引物进行扩增，先后得到1个1 000bp和2个250bp的片段.将3次测序得到的序列拼接，并设计引物利用PCR验证，最终得到1条1 185bp的Vg基因上游序列.

2.2 启动子及调控序列分析

经过分析发现，同大多数真核生物一样，在预测的转录起始位点（＋1位）上游－30～－24bp的区域存在着1个典型的TATA box，但未发现GC box和CAAT box（图2）.综合多个网站的预测结果进行筛选可以看出，中国明对虾Vg基因上游调控区含有多种潜在的顺式作用元件，如SP1，YY1，NF－GMb，GHF1／Pit1，NF1，CDP以及NF－κB等转录因子结合元件（图2）.

图2 1.1kb的中国明对虾卵黄蛋白基因组基因5′上游序列Fig.2 5′upstream fragment of the vitellogenin gene of Fenneropenaeus chinensis and containing the putative cis－regulatory elements in boxes

3 讨论

迄今为止，有关甲壳动物Vn的研究多集中在卵黄蛋白原的合成部位，在外源刺激作用下卵黄蛋白原的合成途径，卵黄蛋白原的结构特性，卵黄蛋白原的生物学功能以及卵黄蛋白原作为检测环境激素的生物标志物的应用等几个方面［5］.鉴于有关Vg基因表达调控机制的研究较为薄弱，本文对中国明对虾卵Vg基因上游序列进行了克隆，并对启动子及顺式作用元件进行了一系列的生物信息学分析.

真核生物基因核心启动子结构一般包含有TATA box，有的基因甚至有多个TATA box.而本课题组发现中国明对虾Vg基因上游序列只有1个TATA box，其存在于转录起始位点上游－30～－24bp处，没有找到典型的CAAT box和GC box，这种缺失可由转录因子来弥补.在所预测的核心启动子上游，利用各种程序找到了多种潜在的顺式作用元件，经过筛选本课题组保留了SP1，YY1，NF－GMb，GHF1／Pit1，CDP以及NF－κB等转录因子的结合元件作为重点进行讨论.

核因子SP1（Specificity Protein 1），属于Sp／KLF家族成员，含有1个锌指蛋白结构域，能直接结合DNA，对多种基因（如核酸代谢相关基因、氧化磷酸化相关基因等）均有调控作用［6］.它既可以正性调控基因转录，也可以对某些基因进行负性调控（包括P21、β类球蛋白基因等）［7－8］.此外，它还参与了细胞的生长和分化、调控细胞周期调控分子、生长相关信号转导通路以及细胞凋亡等过程［9］.

转录因子YY1（yin－yang 1）也是一种至关重要的调控因子，它属于GLI－Kruppel家族的锌指蛋白，其作用元件广泛存在于多个基因中，具有抑制和激活转录的双重功能.例如，人们发现c－fos，loricrin，HDL－R等基因受到YY1的抑制作用，在c－Myc、核糖体蛋白L30基因中YYI起激活作用［10－11］.而Shi等（1991）曾发现，腺病毒E1A蛋白能将YY1从转录阻抑因子转变成转录激活因子.此外，YY1也可以和其他因子共同发挥作用，1996年，Adrian等研究发现，转录因子SP1和YY1共同参与调控了人类转铁蛋白基因，转录因子SP1表现出促进作用，而YY1则显现出抑制作用.

转录因子NF－GMb是冷休克蛋白结构域（cold－shock domain，CSD）蛋白家族成员，一般结合在上游序列靠近启动子的地方.它能抑制一些基因转录如白细胞介素－1β（IL－1β），IL－2，IL－3，IL－8，肿瘤坏死因子－α（TNF－α），IL－2受体－α，干扰素－β（IFN－β），LD78，VCAM－1和ELAM－1等［12－13］，但是在一些外源物质（如聚丙烯酸甲酯）的刺激下能加强基因的转录水平.此外，转录因子NF－GMb还参与了调控组织再生、繁殖、胚胎发育、精子形成以及细胞凋亡等生理过程.

转录因子GHF1／Pit1也叫POU1F1（Pituitary－specific positive transcription factor 1），是一种生长激素基因激活因子，它在调控哺乳动物催乳激素及促甲状腺激素等基因中起到重要的作用［14］.

CDP（CCAAT displacement protein）家族包含多个高度保守的同源蛋白，它们参与细胞的生长、分化和发育.作为一种反式作用因子，CDP往往结合在DNA上游区来抑制基因转录，也可以通过抑制其他转录因子（如NF－κB，AP－2等）的方式来抑制转录［15－16］.

核因子NF－κB是一种重要的调控因子，是由2个Rel蛋白单体组成的二聚物转录因子，能够调控一系列参与细胞生理活动的基因，参与先天性和获得性免疫应答、细胞调亡、炎症、应激和淋巴形成等生理活动［17－19］.

近来，人们经过多方面的研究发现Vg在生物体先天免疫中担负着重要的作用，它作为一个多元的分子识别受体，能识别脂多糖、葡聚糖、肽聚糖、磷壁酸以及病毒等，具有杀菌、抗氧化等功能［20－21］.此外，它在免疫应答等方面也有重要的作用.通过本课题组的实验可以看出在Vg基因上游存在多个与免疫相关的转录因子结合位点，这也有助于对Vn功能的研究.

本实验克隆得到了中国明对虾Vg基因上游调控序列，预测了一些可能与启动子活性或者启动子应答外源刺激有关的转录因子，同时对这些转录因子的功能进行了一些分析.但是，这些转录因子是否在Vg基因中发挥作用仍需进一步的实验验证.

甲壳动物能在短短几天之内积累大量卵黄，说明Vg基因上有1个非常强的启动子.本课题组的实验结果显示，在Vg基因上游序列有多个可能增强启动子功能的转录因子结合位点如NF－κB，YY1，SP1等，因此笔者推测在这些因子的共同作用下Vg基因启动子活性大大增强，从而调控基因短时间内大量合成Vn.在下一步的实验中，会根据这些实验结果对种种预测进行具体的验证，来完善Vg基因启动子调控模式，以便为其以后的应用提供理论支持.

［1］ LEE K W，HWANG D S，RHEE J S，et al.Molecular cloning，phylogenetic analysis and developmental expression of a vitellogenin（Vg）gene from the intertidal copepod Tigriopus japonicus［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2008，150（4）：395－402.

［2］ CALDWELL DANIELJ，MASTROCCO FRANK，ANDERSON PAUL D，et al.Predicted－no－effect concentrations for the steroid estrogens estrone，17β－estradiol，estriol，and 17α－ethinylestradiol［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，2012，31（6）：1396－1406.

［3］ HUTCHINSON THOMAS H，ANKLEY GERALD T，et al.Screening and testing for endocrine disruption in fish－biomarkers as“signposts，”not“traffic lights，”in risk assessment［J］.Environmental Health Perspectives，2005，114（S－1）：106－114.

［4］ 柳峰松，武金霞，谢松，等.成熟中国对虾（Penaeus chinensis）卵巢中卵黄蛋白的纯化［J］.河北大学学报：自然科学版，2001，21（4）：406－410.

LIU Fengsong，WU Jinxia，XIE Song，et al.Purification of vitellin in mature ovary of prawn，Penaeus chinensis［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2001，21（4）：406－410.

［5］ 李兆杰，杨丽君，王静，等.卵黄蛋白原的研究进展［J］.生命科学，2010，22（3）：284－290.

LI Zhaojie，YANG Lijun，WANG Jing，et al.The progress in studies on vitellogenin［J］.Chinese Bulletin of Life Sciences，2010，22（3）：284－290.

［6］ ZAID A，LI R，LUCIAKOVA K，et al.On the role of the general transcription factor Sp1in the activation and repression of diverse mammalian oxidative phosphorylation genes［J］.J Bioenerg Biomembr，1999，31（2）：129－135.

［7］ FENG D，KAN Y W.The binding of the ubiquitous transcription factor Sp1at the locus control region represses the expression of beta－like globin genes［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（28）：9896－9900.

［8］ INNOCENTE S A，LEE J.M p53is a NF－Y－and p21－independent，Sp1－dependent repressor of cyclin B1transcription［J］.FEBS Lett，2005，579（5）：1001－1007.

［9］ 白雪，邓红.转录因子Sp1与肿瘤关系研究的新进展［J］.浙江大学学报：医学版，2010，39（2）：215－220.

BAI Xue.DENG Hong.Research progress on relationship between transcription factor Sp1and tumor［J］.Journal of Zhejiang University：Medical Sciences Edition，2010，39（2）：215－220.

［10］ SHRIVASTAVA A，SALEQUE S，KALPANA GV，et al.Inhibition of transcriptional regulator Yin－Yang－1by association with c－Myc［J］.Science，1993，262（5141）：1889－1892.

［11］ XU Xuezhu，KAWACHI Y，NAKAMURA Y，et al.Yin－yang 1negatively regulates the differentiation－specific transcription of mouse loricrin gene in undifferentiated keratinocytes［J］.Invest Dermatol，2004，123（6）：1120－1126.

［12］ COLES L S，DIAMOND P，OCCHIODORO F，et al.Cold shock domain proteins repress transcription from the GMCSF promoter［J］.Nucleic Acids Res，1996，24（12）：2311－2317.

［13］ FUKUI H.Structure of the histamine H1receptor gene and transcriptional up－regulation of the H1receptor［J］.Nihon Rinsho，1996，54（2）：389－395.

［14］ HOWARD P W，JUE S F，MAURER R A.Expression of the synaptotagmin I gene is enhanced by binding of the pituitary－specific transcription factor，POU1F1［J］.Mol Endocrinol，2009，23（10）：1563－1571.

［15］ WU F，LEE A S.CDP and AP－2mediated repression mechanism of the replication－dependent hamster histone H3.2 promoter［J］.J Cell Biochem，2002，84（4）：699－707.

［16］ UEDA Y，SU Y，RICHMOND A.CCAAT displacement protein regulates nuclear factor－kappa beta－mediated chemokine transcription in melanoma cells［J］.Melanoma Res，2007，17（2）：91－103.

［17］ TSUTSUMI－ISHII Y，NAGAOKA I.NF－kappa B－mediated transcriptional regulation of human beta－defensin－2gene following lipopolysaccharide stimulation［J］.J Leukoc Biol，2002，71（1）：154－162.

［18］ LIANG Yan，ZHOU Yang，SHEN Pingping.NF－kappaB and its regulation on the immune system［J］.Cell Mol Immunol，2004，1（5）：343－350.

［19］ PONPRATEEP SIRIKWAN，THARNTADA SIRINIT，et al.Gene silencing reveals a crucial role for anti－lipopolysaccharide factors from Penaeus monodon in the protection against microbial infections［J］.Fish ＆Shellfish Immunology，2012，32（1）：26－34.

［20］ LI Zhaojie，ZHANG Shicui，ZHANG Jun，et al.Vitellogenin is a cidal factor capable of killing bacteria via interaction with lipopolysaccharide and lipoteichoic acid［J］.Mol Immunol，2009，46（16）：3232－3239.

［21］ ZHANG Shicui，WANG Shaohui，LI Hongyan，et al.Vitellogenin，a multivalent sensor and an antimicrobial effector［J］.The International Journal of Biochemistry ＆Cell Biology，2011，43（3）：303－305.

（责任编辑：赵藏赏）

Cloning and analysis of the promoter of Fenneropenaeus chinensis vitellogenin gene

XlE Song，Ll Lixiang，CHEN Hongjian，SUN Lingling，LlU Fengsong
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Laboratory of Invertebrate Systematics and Application of Hebei Province，Baoding 071002，China）

In order to investigate the mechanism of the expression and regulation of the Fenneropenaeus chinensis vitellogenin gene，the promoter and the up－stream regulatory fragment of 1 100bp were amplified by Genome Walker method.Analysis showed that the“TATA box”was located at－30－24bp in the front of the transcription initiation site，but the“CAAT box”and“GC box”were absent.Meanwhile，among the upstream regulatory region，there were a few cis－acting elements which might affect the activity of promoter，such as NF－κB，YY1，SP1，and so on.These results laid the foundation for us to study the accumulation of the vitellin and the oogenesis of Fenneropenaeus chinensis in depth.

vitellogenin；Genome Walker；promoter；cis－actingelement

Q81

A

1000－1565（2013）02－0175－06

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.012

2012－12－15

河北省自然科学基金资助项目（C2010000256，C2011201027）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20101301120005）；河北大学自然科学基金资助项目（2011218）

谢松（1964－），男，江西寻乌人，河北大学教授，主要从事甲壳类营养与发育研究.

柳峰松（1976－），男，河北任丘人，河北大学教授，从事无脊椎动物分子免疫学研究.E－mail：liufengsong＠hbu.edu.cn