PIN1基因启动子区-667C＞T多态性与慢性肾脏病伴继发性甲状旁腺功能亢进的相关性

赵 玉 张丽丽 曹 平 邓蓉蓉 沈 婕 漆媛媛 王 静

PIN1基因启动子区-667C＞T多态性与慢性肾脏病伴继发性甲状旁腺功能亢进的相关性

赵 玉 张丽丽 曹 平 邓蓉蓉 沈 婕 漆媛媛 王 静

目的：研究PIN1基因启动子区-667C＞T位点基因多态性与中国西北汉族人群慢性肾脏病（CKD）继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT）的相关性。 方法：应用聚合酶反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测252例CKD伴SHPT患者及61例健康体检者PIN1基因启动子区-667C＞T位点基因型和等位基因频率。基因组测序法验证PIN1基因多态性。 结果：CKD伴SHPT组和健康对照组间性别、年龄相匹配。CKD伴SHPT组估算的肾小球滤过率（eGFR）、血清钙显著低于健康对照组（P均＜0.05）；血清肌酐（SCr）、血清磷、全段甲状旁腺激素（iPTH）均显著高于健康对照组（P均＜0.05）。CKD伴SHPT组PIN1基因启动子区-667T变异基因型（CT＋TT）和T等位基因的频率均高于健康对照组（χ2＝12.47，P＜0.01；χ2＝3.83，P＝0.05）。-667T变异基因型（CT＋TT）与PTH相关（OR＝1.002，P＝0.039），而与性别、年龄、SCr、血清钙、血清磷等指标均无相关。PIN1基因启动子区-667T变异基因型（CT＋TT）可能是CKD伴SHPT的危险因素（OR＝3.219，95%CI 1.643～6.037）。 结论：中国汉族人群PIN1基因-667C＞T多态性可能与CKD伴SHPT易感性相关。-667T变异基因型（CT＋TT）可能是CKD伴SHPT的危险因素。

慢性肾脏病 继发性甲状旁腺激素亢进 PIN1基因 多态性 单核苷酸

继发性甲状旁腺功能亢进（SHPT）是慢性肾脏病（CKD）患者常见并发症之一，其主要特征是甲状旁腺激素（PTH）水平升高［1］。肽酰脯氨酰顺／反异构酶（Pin1）是 PTH mRNA稳定性的关键调节者［2－4］。Naveh-Many等［5］研究发现在PIN1基因敲除小鼠中血清PTH和PTH mRNA水平升高，而未发现血清钙和磷的变化，表明在体内Pin1决定基础的PTH的表达。Nechama等［3］研究发现在低钙饮食诱导的SHPT小鼠模型或腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中Pin1的活性是降低的，低活性的 Pin1导致PTH mRNA稳定性增加，使更多的PTH在核糖体中合成，最终导致SHPT。本研究旨在探讨PIN1基因启动子区-667 C＞T位点多态性与CKD伴SHPT的关系。

对象和方法

研究对象 选取252例2012年1月至2012年12月在兰州大学第二医院肾病科就诊的依据 K／DOQI指南明确诊断为CKD的非透析伴SHPT的患者及61例性别、年龄相匹配的健康体检者作为研究对象。所有受试者均为中国汉族人，均无血缘关系。

SHPT的诊断标准：全段甲状旁腺激素（iPTH）正常值为10～69 pg／ml。参照K／DOQI指南CKD不同分期iPTH目标值，CKD各期中iPTH大于该目标值则诊断为SHPT：CKD 3期［估算的肾小球滤过率（eGFR）30～59 m l／（min·1.73m2）］iPTH＞70 pg／ml；CKD 4期［eGFR 15～29 ml／（min·1.73m2）］iPTH＞110 pg／m l；CKD 5期［eGFR＜15 ml／（min· 1.73m2）］iPTH＞150 pg／ml。

CKD伴SHPT组252例患者中男138例，女114例，平均47.48±16.04岁。原发病包括慢性肾小球肾炎105例（其中IgA肾病24例，局灶节段性硬化性肾炎11例，微小病变型肾病（MCD）13例，系膜增生性肾炎16例，膜性肾病16例，病理不详25例），慢性小管间质性肾炎28例，高血压肾病35例，糖尿病肾病38例，狼疮性肾炎18例，过敏性紫癜性肾炎16例，其他包括多囊肾、梗阻性肾病等12例。健康对照组61例中男31例，女30例，平均47.46± 13.12岁，无高血压、糖尿病及肾脏疾病。

排除标准：年龄＜18岁，合并急性肾损伤，感染，中毒，肿瘤，肝功能不全，原发性甲状旁腺功能亢进，服钙剂、磷结合剂和维生素D制剂，妊娠。

方法

临床及实验室检查 收集两组性别、年龄、血清肌酐（SCr）、血清钙、血清磷、iPTH、eGFR等指标。SCr、血清钙、磷采用自动生化仪检测。采用放射免疫法检测iPTH。eGFR计算根据CKD-EPI［6，7］公式：女性：（1）SCr≤0.7 mg／dl，EPI-GFR＝144×（SCr／0.7）－0.329×0.993年龄； （2）SCr＞0.7 mg／ml，EPI-GFR＝144×（SCr／0.7）－1.209×0.993年龄；男性：（1）SCr≤0.9 mg／dl，EPI-GFR ＝144×（SCr／0.9）－0.411×0.993年龄；（2）SCr＞0.9 mg／ml，EPIGFR＝144×（SCr／0.9）－1.209×0.993年龄。SCr单位换算：1μmol／l＝88.4 mg／dl。

DNA提取 采外周血静脉血2 ml，EDTA抗凝，按照UNIQ-10柱式血液基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）说明书提取 DNA，标本置于 －20℃保存。

PIN1基因多态性检测 应用聚合酶反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR-RFLP）检测PIN1基因启动子区-667C＞T位点的单核苷酸多态性（SNP），基因测序验证。基因突变位于启动子区域影响基因转录，可促进或抑制蛋白表达。参考Genbank SNP数据库，选取MAF＞5%的1个常见多肽位点：-667C＞T［rs2233679］。

引物及PCR扩增条件 依据PIN1基因的核苷酸序列设计扩增引物，由上海生工合成。上游引物5′-CGGGCTCTGCAGACTCTATT-3′，下游引物5′-AAATTTGGCTCCTCCATCCT-3′，扩增长度为296 bp。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，37个循环，72℃延伸7min。PCR反应结束，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果（图1）。

图1 PIN1基因PCR扩增片段

扩增产物的限制性酶切 应用限制性内切酶SacI酶切PCR扩增产物，37℃16h孵育，采用3.0%琼脂糖凝胶，经凝胶成像分析系统拍照后，分析判断基因型。-667C＞T三种基因型分别为：CC型为纯合子，仅有296 bp一个片段；CT型为杂合子，含有296 bp、213 bp和83 bp三个片段；TT型为纯合子，含有213 bp和83 bp两片段（图2）。

基因型测序分析结果 随机从病例对照中分别选取30例样本，PCR产物送上海生工生物工程公司测序，其结果与PCR-RFLP方法鉴定结果一致，所以可以认为本实验的PIN1基因型的结果判定是真实与可靠的（图3）。

图2 PIN1基因启动子区-667C＞T三种基因型酶切结果图

图3 测序确定PIN1-667C＞T基因型（A：CC型；B：CT型；C：TT型）

PIN1基因-667C＞T哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验 HWE，也称遗传学平衡定律，是指在没有进化影响下基因一代一代传递时，群体的基因频率和基因型频率保持不变。即随机交配一代以后基因型频率将保持不变：p2表示AA基因型的频率，q2表示aa基因型的频率，2pq表示Aa基因型的频率，其中p是A基因的频率，q是a基因的频率。基因型频率之和应等于1，即p2＋2pq＋q2＝（p＋q）2＝1。

Finetti程序分析PIN1基因-667C＞T HWE平衡，对照组观察值与对照组预期值基因型分析频率无统计学意义（P＞0.05），即PIN1基因-667C＞T基因型分布符合HWE平衡（表1）。

表1 PIN1基因-667C＞T HWE平衡

统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。基因频率按HWE平衡定律计数，基因型及等位基因频率比较采用四格表资料的χ2检验。正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较用t检验。非正态分布的计量采用M（四分位数间距），组间比较采用秩和检验。计数资料采用 χ2检验。关联性分析采用 Mantel-Haenszel法计算比值比（OR）。CKD SHPT的危险因素分析采用非条件Logistic二元回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

临床资料 CKD伴SHPT组和健康对照组的性别、年龄相匹配。CKD伴SHPT组eGFR、血清钙显著低于健康对照组（P＜0.05）；SCr、血清磷、iPTH均显著高于健康对照组（均P＜0.05）（表2）。

PIN1基因启动子区-667C＞T基因型频率分布CKD伴SHPT组与健康对照组三种基因型（CC，CT及TT）频率比较，其中CC基因型在CKD伴SHPT组中占11.51%，对照组占29.51%，而CT＋TT基因型频率在CKD SHPT组和对照组分别是88.94%和70.50%，两组比较存在显著性差异（χ2＝12.47，P＝0.000＜0.05；OR＝1.26，95%CI＝1.06～1.49），有统计学意义，见表3。说明CKD SHPT与PIN1基因启动子区-667C＞T多态性有关联。

表2 两组患者的临床资料

PIN1基因-667C＞T等位基因频率分布 CKD伴SHPT组T等位基因频率明显高于健康对照组（χ2＝3.83，P＝0.05；OR＝1.25，95%CI＝0.99～1.59）（表3）。说明CKD伴SHPT与PIN1基因启动子区-667C＞T多态性有关联，-667T变异基因可能是 CKD伴 SHPT的易感因素。其次，CKD伴SHPT组和健康对照组C等位基因频率（50.79／60.66）均高于T等位基因频率（49.21／39.34），这与资料显示的中国人C等位基因频率高于T等位基因频率相符合［8］。

表3 两组PIN1基因启动子区-667C＞T位点基因型及等位基因频率分布的比较［n（%）］

CKD伴SHPT组不同基因型间的比较 252例CKD患者中，CC型29例，CT＋TT基因型223例，两基因型组间年龄、性别、SCr、eGFR、血清钙及血清磷等指标的差异均无统计学意义，但是CT＋TT型患者iPTH明显高于CC型患者（P＜0.05）（表4）。

表4 CKD伴SHPT组不同基因型间的比较

CKD伴SHPT的危险因素分析 以CKD伴SHPT为应变量，选择基因型、年龄、性别、SCr、eGFR、血清钙、血清磷及iPTH等指标为自变量分别进行单因素非条件Logostic二元回归分析结果显示，基因型、eGFR、血清钙、血清磷及iPTH与CKD伴SHPT密切相关，而与SCr无统计学意义（表5）。多因素回归分析显示，校正eGFR、血清钙、血清磷及iPTH后，PIN1基因-667T变异基因型（CT＋TT）的B值为2.250，Wald值为10.064，OR值＝12.693，95%CI2.029～75.819。

PIN1基因-667T变异基因型与临床资料的关联性分析 关联性分析采用Mantel-Haenszel法，结果显示PIN1基因-667T变异基因型（CT＋TT）与iPTH有相关性（OR＝1.002，P－0.039＜0.05），而与性别、年龄、SCr、血清钙、血清磷等指标均无相关。

表5 CKD伴SHPT危险因素二元回归分析

讨 论

Pin1归属于多肽脯氨酸基顺反同分异构酶家族的Pin1型亚家族，是通过酵母杂交确定的对酵母和人类细胞分裂均有作用的功能蛋白，具有高度保守性和特异性。它可特异性地结合磷酸化的丝／苏-脯氨酸基因序列，通过催化顺／反异构酶的肽键，从而改变其生物活性和磷酸化［9－11］。Pin1催化的构象变化对许多磷酸化信号途径产生深远影响［12，13］。近年研究发现Pin1对PTH mRNA的稳定性有一定的调节作用［2－4］。

Pin1对PTH mRNA稳定性的调节是通过PTH mRNA 3′-非编码区（UTR）腺嘌呤尿嘧啶丰富的元件（ARE）和mRNA衰变因子K同源剪接调控蛋白（KSRP）［14，15］相互作用实现的。S181位点磷酸化的KSRP是无活性的。顺反异构化的脯氨酸黏附于KSRP导致其构象发生改变，使得磷酸化的S181位点暴露，Pin1与其相互作用导致KSRP去磷酸化，激活KSRP。活化的KSRP与PTH mRNA相互作用使其降解增加、编码减弱。而腺嘌呤尿嘧啶丰富的元件结合蛋白1（AUF1）［16，17］可视为KSRP竞争性的拮抗剂，其与PTH mRNA结合增加PTH mRNA稳定性，抑制PTH mRNA降解，增加PTH mRNA水平，最终使得血清中PTH水平升高。

研究发现在PIN1基因敲除小鼠中血清PTH和PTH mRNA水平升高，而未发现血清钙和磷的变化，表明在体内PIN1决定基础的PTH的表达［5］。Nechama等［3］研究发现在低钙饮食诱导的SHPT小鼠模型或腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中Pin1的活性是降低的。因Pin1活性降低，去磷酸化的KSRP（活化KSRP）数量减少［14］，可与PTH mRNA 3′-UTR ARE结合的数量减少，使PTH mRNA降解减少；间接使得AUF1占主导地位，与PTH mRNA 3′-UTR ARE结合作用增强，增加PTH mRNA的半衰期和稳定性，增加了PTH mRNA水平，使更多的PTH在核糖体中合成，最终导致SHPT。因而，我们推测可能是PIN1基因的突变影响了其基因转录，抑制了PIN1蛋白的表达，使其生物学活性降低，活化的KSRP减少，PTH mRNA半衰期和稳定性增加，最终导致PTH水平升高。

PIN1基因存在许多单核苷酸多肽性位点，参考Genbank单核苷酸多肽数据库（http：／／www.ncbi. nlm.nih.gov），-667C＞T［rs2233679］位点MAF＞5%，其位于PIN1基因5′端-667处（以起始密码子ATG的A为＋1）。Hapmap数据库显示-667位点为CC型、CT型、TT型基因型在中国人群中的频率分别为34.5%、51.2%、14.3%。目前，国内外仅研究报道了PIN1基因启动子区该位点多态性与肿瘤的发生有一定的关联，而未见任何文献报道该位点与CKD伴SHPT的关联［8，18，19］。因此，我们筛选-667C＞T作为PIN1基因启动子区可能的功能性变异位点进行多态性与CKD伴SHPT的关联性分析。

本研究显示中国西北地区汉族人群PIN1基因启动子区-667位点存在C和T等位基因，CKD伴SHPT患者和健康体检者均以杂合突变的CT基因型多见，分别是78.75%和62.30%，其次为CC基因型，分别占CKD伴SHPT患者和健康体检者的11.51%和29.5%，而TT基因型仅占9.92%和8.2%。CKD伴SHPT患者-667T变异基因型（CT＋TT）和T等位基因频率明显高于健康体检者，且关联性分析发现-667T变异基因型（CT＋TT）和T等位基因比值比（OR＝1.26；OR＝1.25）均大于1（P≤0.05），表明PIN1基因启动子区-667C＞T位点的基因多态性与CKD伴SHPT的发病具有相关性。

非条件Logistic二元回归分析显示，PIN1基因启动子区-667C＞T位点基因型、eGFR、血清钙、血清磷及iPTH与CKD伴SHPT密切相关；多因素校正eGFR、血清钙、血清磷及 iPTH后，PIN1基因-667T变异基因型（CT＋TT）仍与CKD SHPT密切相关，故我们认为PIN1基因-667T变异基因型（CT＋TT）是CKD SHPT发病的危险因素。进一步分析显示PIN1基因-667T变异基因型（CT＋TT）与iPTH有相关性。

综上所述，中国西北汉族人群PIN1基因启动子区-667C＞T位点基因多态性可能与CKD伴SHPT易感性相关，该位点变异基因型（CT和TT）和T等位基因可能是CKD伴SHPT的危险因素。本研究将为寻找防治CKD伴SHPT的基因靶点提供理论依据。

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Correlation of PIN1 gene promoter region-667C＞T polymorphism w ith secondary hyperparathyroidism of chronic kidney disease

ZHAO Yu，ZHANG Lili，CAO Ping，DENG Rongrong，SHEN Jie，QIYuanyuan，WANG Jing
Department ofNephrology，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China Corresponding author：WANG Jing（E-mail：xiaoyu123226＠hotmail．com）

Objective：To investigate the correlation of PIN1 gene promoter region-667C＞T polymorphism with chronic kidney disease（CKD）secondary hyperparathyroidism（SHPT）of Chinese Han population in Northwest China. Methodology：A total of two hundred and fifty two non-dialysis CKD patientswith SHPTwere enrolled in this single center study.At the same time，61 healthy volunteerswere enrolled as control.The genotype and allele frequency of-667C＞T site in PIN1 gene promoter were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）.The polymorphism of PIN1 genewas verificated by genome sequencing. Results：CKD SHPT group and the healthy control group were matched in gender and age.Patients with SHPT had higher levels of SCr，serum phosphorus，intact parathyroid hormone（iPTH）and lower levels ofestimated glomerular filtration rate（eGFR），and serum calcium than that healthy control group（all P＜0.05）.PIN1 gene promoter-667T variant genotypes（CT＋TT）and T allele frequency in CKD SHPT group were significantly higher than those in healthy control group（χ2＝12.47，P＝0.000＜0.05；χ2＝3.83，P＝0.05）.-667T variant genotypes（CT＋TT）in patients with CKD SHPT were not related to gender，age，SCr，serum calcium，and serum phosphorus（all P＞0.05）except iPTH（OR＝1.002，P＝0.039）.PIN1 gene promoter-667T variant genotypes（CT＋TT）were the risk factor of CKD SHPT（OR＝3.219，95%CI 1.643～6.037）. Conclusion：PIN1 gene promoter-667C＞T polymorphism may be associated with the susceptibility to CKD SPTH.-667T varivant genotypes（CT＋TT）are the risk factor of CKD SHPT in Chinese Han population in Northwest China.

chronic kidney disease secondary hyperparathyroidism PIN1 gene polymorphism single nucleotide

2013-07-31

（本文编辑 律 舟 春 江）

兰州大学第二医院肾内科（兰州，730030）

王 静（E-mail：xiaoyu123226＠hotmail.com）ⓒ2013年版权归《肾脏病与透析肾移植杂志》编辑部所有