二角菱壳和四角菱壳不同提取物抗氧化能力比较研究※

裴 刚胡乔铭向德标罗李娜丁扬洲袁 园

二角菱壳和四角菱壳不同提取物抗氧化能力比较研究※

裴 刚1胡乔铭2向德标2罗李娜2丁扬洲2袁 园1

目的研究不同菱角壳不同溶剂的提取物的抗氧化能力。方法采用DPPH法分别测定二角菱角壳、四角菱角壳氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水提取浸膏的抗氧化能力，同时与抗坏血酸、槲皮素、没食子酸标准品进行了对比。结果用同一溶剂提取时，二角菱壳提取浸膏的 IC50值均高于四角菱壳提取浸膏；同一种菱角壳用不同溶剂提取时，其提取浸膏与标准品相比 IC50值为：氯仿浸膏＞水浸膏＞乙醇浸膏＞抗坏血酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞没食子酸，即其清除 DPPH自由基能力的顺序为：没食子酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞抗坏血酸＞乙醇浸膏＞水浸膏＞氯仿浸膏。结论菱角壳具有较好的抗氧化能力。四角菱壳抗氧化能力强于二角菱壳，菱角壳乙酸乙酯提取部分清除DPPH自由基的能力最强。

氧自由基；DPPH；二角菱壳；四角菱壳

菱角为菱科植物菱或细果野菱的干燥果实[1]。前期的工作显示，浙江产二角菱壳（Trapa bicornis Var.bispinosa）和湖南产四角菱壳（Trapa natans L.Var.incisa Makino）提取物对肺癌A549细胞具有较强的生长抑制作用[2]。诱发肿瘤的因素很多，现代研究表明，肿瘤的始发和促生阶段具有氧自由基形成及出现细胞增殖水平的增高，因此清除氧自由基核抑制细胞增殖水平成为预防和治疗肿瘤的一项措施[3]。DPPH自由基结构简单、性质稳定、反应容易控制，是抗氧化剂自由基清除活性筛选的常用试剂；DPPH比色法也仅需要分光光度计，简单、方便，实验条件容易满足[4]。本文以不同溶剂对上述菱角壳进行提取，研究提取物对DPPH自由基的清除能力，为菱角壳的抗癌药理活性探索提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器UV-1750紫外可见分光光度计（岛津仪器有限公司）；AL204型电子分析天平（梅特勒托利多公司）；FW135中药材粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 材料菱角于2010年10月分别采于浙江和湖南，经中南林业大学生命科学院植物学教研室马英姿副教授鉴定分别为菱科植物二角菱（Trapa bicornis Var.bispinosa）和四角菱（Trapa natans L.Var.incisa Makino）的干燥果实。标本存于湖南中医药大学药学院中药化学教研室。

1.3 试剂DPPH（1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基，日本和光纯药工业株式会社）；抗坏血酸、槲皮素、没食子酸标准品（中国药品生物制品检定所）；其余试剂均为AR。

2 实验方法

2.1 菱角壳提取浸膏制备称取二角菱壳、四角菱壳药材粗粉各33.7g、34.4g，用滤纸包好分别置于索氏提取器中，按极性由小到大的顺序依次用氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水，加热回流提取3h。分别回收溶剂，水浴蒸干，干燥器内干燥 24h，得黑褐色浸膏，称重，则得到 8个样品即二角菱壳氯仿浸膏1.2g，四角菱壳氯仿浸膏 1.3g，二角菱壳乙酸乙酯浸膏5.5g，四角菱壳乙酸乙酯浸膏4.2g，二角菱壳乙醇浸膏7.6g，四角菱壳乙醇浸膏5.5g，二角菱壳水浸膏2.5g，四角菱壳水浸膏1.8g。

2.2 试液的制备

2.2.1 DPPH溶液的配制精密称取DPPH10mg，溶于少量95%乙醇中，定容至250mL，即得浓度为0.04mg/mL 溶液，置于冰箱中冷藏备用。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取抗坏血酸、槲皮素、没食子酸对照品20.3mg、20.4mg、10.1mg，分别置于100mL容量瓶中，加入95%乙醇稀释至刻度，摇匀，得 203μg/mL抗坏血酸对照品溶液、204μg/mL槲皮素对照品溶液、101μg/mL没食子酸对照品溶液，再参考文献，按2倍倍比稀释分别得抗坏血酸、槲皮素、没食子酸相应的8个不同浓度药液。

2.2.3 供试品溶液制备精密称取 2.1中制备的各样品20.1mg、39.0mg、4.2mg、4.1mg、8.5mg、4.3mg、8.1mg、8.1mg，分别用相应溶剂溶解并定容至10mL，摇匀，得2.01、3.90、0.42、0.41、0.85、0.43、0.81、0.81mg/mL的第一浓度初始液，再按2倍倍比稀释分别得样品B1-B8相应的8个不同浓度药液。

2.3 DPPH自由基稳定性实验取浓度为203μg/mL的抗坏血酸和浓度为3.90mg/mL的样品B1溶液，按照2.4.1项下方法加样，每隔2 min测定吸光度值Ai，直到Ai值基本稳定。吸光度值Ai在加入抗氧化剂的最初20min内下降较快，在20～30min内，反应体系的Ai值变化缓慢，30min后Ai值基本保持不变。因此选择测定菱壳提取浸膏与DPPH自由基的反应时间为30min。

2.4 清除DPPH能力的测定方法

2.4.1 清除率的测定参考文献精密量取DPPH溶液2.5mL、对照品溶液和供试品溶液分别为0.5mL，于510nm处测定各吸光值（A），每一吸光值平行测定3次，按下公式计算DPPH自由基清除率：

2.4.2 半清除率的测定按 2.4.1下的操作步骤测定待测液DPPH自由基清除率，绘制DPPH自由基清除率对待测液浓度标准曲线，通过线性方程计算出DPPH自由基清除率为50%时所需对照品、不同菱角壳提取浸膏浓度，即IC50值。IC50值越低，DPPH自由基清除率达50%时所需抗氧化剂浓度越低，表明该抗氧化剂清除自由基的能力越强。

3 结果与讨论

通过测定各抗氧化剂清除DPPH能力的指标为IC50值，其比较结果见下表1。

表1 抗氧化剂浓度与清除率关系

由表 1实验结果可知，不同种类菱角壳用同一溶剂提取时，二角菱壳提取浸膏的 IC50值均高于四角菱壳提取浸膏，即四角菱壳提取浸膏清除DPPH自由基的能力强于二角菱壳提取浸膏；同一种菱角壳用不同溶剂提取时，其提取浸膏与标准品相比 IC50值为：氯仿浸膏＞水浸膏＞乙醇浸膏＞抗坏血酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞没食子酸，即其清除 DPPH自由基能力的顺序为：没食子酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞抗坏血酸＞乙醇浸膏＞水浸膏＞氯仿浸膏，乙酸乙酯部分清除DPPH自由基的能力最强。表明菱角壳中主要的抗氧化活性成分溶于乙酸乙酯等极性溶剂中，其中的弱极性成分不具备良好的抗氧化能力，则奠定了以后的分离抗氧化活性单体实验中以乙酸乙酯浸膏为主的基础。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部)[M].北京：中国中医出版社.附录[III],2010.

[2] 伍茶花,丁扬州,裴刚,等.不同菱角壳提取物对肺癌A549细胞生长抑制研究[J].湖南中医药大学学报,2012,32(1)：27-30.

[3] 尹卫平,梁菊,吴文澜.抗癌天然药物研究进展[M].北京：科学出版社,2009.

[4] 宁杰,岳峰,巴媛媛,等.甜菊叶提取物清除DPPH 能力的研究[J].中国食品学报,2011,11(6)：27-34.

R917

A

1673-5846(2013)07-0225-02

1湖南中医药大学药学院，湖南长沙 410208

2湖南中医药大学硕士研究生，湖南长沙 410208

湖南省教育厅资助项目(12C0272)；2011年度湖南中医药大学研究生科研创新项目课题资助；2012年度湖南中医药大学研究生创新性课题资助

袁园（1984-），女，硕士，助理实验师；研究方向：中药及其复方化学成分研究；E-mail：yykakashi@163.com，电话：13787208503。