响应面法优化海洋微生物发酵产生纤溶化合物的培养条件

苏同伟，包斌,，严婷，张朝燕,3，卜永士，吴文惠,3

1 上海海洋大学食品学院，上海 201306

2 上海水产品加工与贮藏工程技术研究中心，上海 201306

3 上海海洋大学海洋科学研究院，上海 201306

海洋微生物因其种类多样性及所处的高压、低温、缺氧等独特的生态环境，常常能够产生优良生物活性且结构新颖的天然化合物[1]，海洋微生物代谢产物已经成为创新药物发现的重要来源[2-3]。

海洋微生物长孢葡萄穗霉菌 FG216(Stachybotrys longispora FG216)是分离自东海海域的海洋真菌[4]，其代谢产物 FGFC1(Fungi fibrinolytic compound 1)是具有溶血栓作用[5]的小分子生物活性化合物，FGFC1特异作用于纤溶酶原和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂，可使生理的纤溶反应平稳进行，避免机体广泛出血风险及过敏反应，有可能成为安全而高效的溶血栓新药。

本实验通过Box-Behnken 模型[6-7]分析发酵温度、发酵时间、诱导物(鸟氨酸盐酸盐)添加量对FGFC1产量的影响，从而得出FG216发酵生产FGFC1的最佳培养条件。

1 材料与方法

1.1 菌株

长孢葡萄穗霉菌 FG216(Stachybotrys longispora FG216)为本实验室筛选获得。保藏号：CCTCC M 2012227，中国典型培养物保藏中心。

1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖35 g，可溶性淀粉10 g，脱脂大豆粉20 g，细菌学蛋白胨5 g，牛肉膏蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，氯化钠2 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.05 g，加蒸馏水1000 mL，调pH至5.8，灭菌。

发酵培养基：蔗糖50 g，硝酸钠3 g，磷酸氢二钾0.1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g ，酵母提取物1 g，氯化钴0.0025 g，硫酸亚铁0.015 g，氯化钙0.0065 g，鸟氨酸盐酸盐，加蒸馏水1000 mL，调pH 至5.8，灭菌。

1.3 FGFC1标准曲线及线性关系

精确称取FGFC1配制成甲醇标准液，并梯度稀释为1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL、0.005 mg/mL 的标准样品，用HPLC 进行检测，平行3次，以峰面积值为Y 轴，样品浓度为X 轴作图，得到FGFC1标准曲线方程为Y=9000000X，R2=0.9998。

1.4 单因素试验设计

1.4.1 诱导物添加量对FGFC1产量的影响

基础发酵培养基为除去诱导物的发酵培养基，分别添加0.5%、1%、1.5%、3%、5%的诱导物。取活化的种子液按1%接种到发酵培养基，考虑到海洋微生物大多为嗜冷微生物，其最适温度在20℃以下，因此设定培养温度为19℃，摇床转速为180 r/min，连续检测3～9 d 发酵液中的FGFC1产量，诱导剂添加量各水平组中FGFC1产量均在第8天达到最高，以该培养时间的FGFC1产量确定最优的诱导物添加量。

1.4.2 培养时间对FGFC1产量的影响

取活化的种子液按1%比例接种到最优诱导物添加量的发酵培养基中，因19℃时FGFC1产量较低，并初步探索FGFC1产量与培养温度之间的关系，尝试将培养温度升高为22℃，摇床转速为180 r/min，3～9 d 取发酵液进行FGFC1产量检测以确定最优发酵时间。

1.4.3 培养温度对FGFC1产量的影响

取活化的种子液按1%比例接种到最优诱导物添加量的发酵培养基，比较1.4.1与1.4.2试验中升高温度后FGFC1产量的变化趋势，将培养温度设定为19℃、22℃、25℃、28℃，摇床转速180 r/min，在最优的培养时间取发酵液对FGFC1产量检测以确定最优的培养温度。

1.5 响应面最优试验设计

根据单因素试验结果，通过Box-Behnken 模型以培养时间、诱导物添加量、培养温度为自变量，以FGFC1产量为响应值设计响应面试验拟合自变量与响应值之间的函数关系[8-9]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素实验结果表明，最优的培养时间为8 d，最优的诱导物添加量为1.5%，最优的培养温度为25℃。但各个单因素最优条件简单的组合并不一定是发酵的最优条件[10-11]，需要在单因素基础上进行响应面试验来确定最优的发酵培养条件。选择培养时间为7～9 d，诱导物添加量为0.5%～2.5%，培养温度为22℃～28℃作为响应面试验水平范围，FGFC1产量为响应值进行响应面试验。

2.2 三因素响应面试验分析

2.2.1 模型的建立及分析

以培养时间、诱导物添加量、培养温度为试验因素，FGFC1产出量为评价指标，按照二次项回归方程进行试验。试验设计及结果见表1。

针对表1应用Design-Expert V8.0.6软件进行多元回归拟合[12-13]，可得培养时间(A)、诱导物添加量(B)、培养温度(C)与响应值FGFC1产量(Y)的关系，其方程式：Y＝1251.96+71.17A−393.62B+472.83C−45.54AB+65.53AC−371.54BC−93.60A2−119.98B2−380.91C2。

根据响应面试验结果，回归模型的方差分析列入表2。

表1 培养时间、诱导物添加量、培养温度的响应面试验设计及各试验的FGFC1产出量Table 1 The design of response surface methodology concerning fermentation time,ornithine hydrochloride quantity and fermentation temperature and the volume of production of FGFC1 from every experiment

表2 回归模型方差分析Table 2 ANOVA of response surface model

根据表2可以看出，试验模型的P 值小于0.0001，模型极显著，失拟项P 值为0.5432，大于0.05，这表示试验数据与模型拟合良好。通过对P值检验可以看出，培养时间、诱导物添加量、培养温度以及它们的二次项对FGFC1产量的影响都是显著的，且诱导物与温度的交互作用对FGFC1产量的影响同样显著。同时，模型的复相关系数R2=0.9911，调整后R2=0.9796。从上述数据可以看出，此模型可以很好地反映FGFC1产量与培养时间、诱导物添加量、培养温度之间的关系，可以用来对FGFC1产量进行优化分析与预测。

2.2.2 培养条件优化及验证

在培养时间为8 d 时，诱导物添加量与培养温度对FGFC1产量的影响见图1。

图1 诱导物添加量与培养温度对FGFC1产量的影响Fig.1 Effect of ornithine hydrochloride addition and culture temperature on FGFC1 production.

通过响应面结果分析，仅培养温度与诱导物添加量之间交互作用显著。培养温度接近28℃时FGFC1产量最大，当温度达到28℃时其产量有所下降。而诱导物添加量为0.5%时，FGFC1的产量最大，随后FGFC1的产量随着诱导物添加量的增加而减少。

利用Design-Expert V8.0.6软件对培养条件进行优化，得出最优培养条件为培养时间8.97 d，诱导物添加量0.5%，培养温度27.8℃，FGFC1产量理论值为2077.77 mg/L。根据实际情况将最优条件调整为培养时间9 d，诱导物添加量0.5%，培养温度28℃。通过多次验证实验得到FGFC1产量均值为1978.33 mg/L，相对偏差为4.8%，表明Box-Behnken 模型用于FG216发酵条件的优化是有效可靠的。

3 结论与讨论

本试验利用Box-Behnken 模型对FG216发酵产生FGFC1的培养条件进行优化，方差分析表明模型拟合度良好。最优的培养条件为培养时间9 d，诱导物添加量0.5%，培养温度28℃，通过培养条件优化，FGFC1产量由优化前的约700 mg/L 提高到1978.33 mg/L。结果表明，通过对培养时间、诱导物添加量和培养温度的响应面优化是成功有效的，为提高FGFC1的产量提供了技术支持，对保证后续的临床前试验需求及加快FGFC1作为新型溶栓药物出现具有重要意义。

长孢葡萄穗霉菌FG216是一种稀有真菌，自1975年被发现以来鲜有研究报道，其生物学特性尚未完全明确。相关研究[14-16]提示我们，可以从更多方面进一步提高FGFC1的产量。

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