淡水藻类的分离纯化方法探索

王梅梅，熊亚南，刘爱华，章广玲

（河北联合大学，河北唐山063000）

淡水藻类的分离纯化方法探索

王梅梅，熊亚南，刘爱华，章广玲

（河北联合大学，河北唐山063000）

以唐山市水源水和终端水为实验材料，对淡水藻类的分离纯化方法进行了探索，大致分为以下九种：培养基筛选法、稀释分离法、平板划线分离法、离心分离法、毛细管分离法、小滴分离法、pH值分离法、温度分离法、抑制剂分离法。同时探索淡水藻类保藏方法。

藻类；分离纯化；方法

近年来，对淡水藻与水体污染之间的关系的研究有很大发展，不仅补充了水质化学分析的不足，而且被广泛用于评价、监测和预报水质的情况［1］。某些藻类在环境保护中作为水质监测的指示生物，可以标志水体的污染程度［2］。目前，国内许多城市的供水水源多为湖泊或水库，随着工农业经济的发展，人类活动所产生的大量营养物质和有毒物质排入水域，造成水库、湖泊的水体污染。由于藻毒素的危害性比较大，目前对藻毒素的研究越来越重视。研究藻类毒素首先要分离产毒藻种。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 水样

（1）自来水水样

取样地点：河北联合大学。

取样时间：2011年3月～2012年3月。（2）水源水水样

取样地点：陡河水库。

取样时间：2011年3月～2012年3月。

1.1.2 培养基

HGZ培养基［3］：用于大多数藻类的培养，蓝藻生长最佳；

水生104号含氮培养基［4］中加入葡萄糖（0.05g／L）：用于大多数藻类的培养；

自制的硅藻培养基：培养硅藻。配方：Ca（NO3）20.01g，MgSO40.01g，K2HPO40.01g，Na-SiO30.025g，KNO30.04g，蒸馏水1000ml。

1.1.3 染液［5］

鲁哥氏碘液；中性红；梅氏苏木色素等。

1.2 水样的采集和培养方法

1.2.1 水样的采集方法

自来水水样：酒精灯灼烧水龙头5min，放水5min，取样时在水柱周围点燃用纱布缠绕的火圈，形成局部无菌区，用已灭菌的三角瓶取样。

水厂水和水源水水样：用75%酒精浸泡过的塑料桶装样采集水厂水水样，采样后迅速运回实验室。

1.2.2 培养方法

液体培养：在三角瓶中培养，接种比例为V培养基∶V水样＝1∶2。

固体培养：液体培养基中加入1.5%的琼脂，培养皿中加入约1cm厚的培养基，加0.2ml藻液，涂布。

培养条件：（28±1）℃、24h连续光照（2000Lux）静置培养。

1.3 藻类分离方法

1.3.1 培养基筛选法

根据不同藻类对营养物、离子等需求不同而选出不同的培养基，利用这些培养基对藻类进行初步富集筛选。

使用的培养基有：HGZ培养基，水生104号含氮培养基＋葡萄糖，自制的硅藻培养基。

1.3.2 稀释分离法［4，6］

用5个无菌试管，在第一个试管中加入蒸馏水10ml，第2～5个试管中都加入5ml蒸馏水。在第一个试管中加藻类混合液1～2滴，充分振荡，使其均匀稀释。然后用消毒移液管吸取第一个试管中混有藻的液体5ml加入第二个试管中，如前振荡，使其均匀稀释。以后依次同样加入第3～5试管，并都充分振荡，使其均匀稀释。然后分别镜检5个试管，如在1滴中只发现2～3个同一藻类个体，将这个试管作为原液，分别取1滴加到装有培养基的小指管中。做大量的分离，将其放入光照培养箱中培养。

1.3.3 平板划线分离法［4，5］

在筛选出的培养基中加入2%的琼脂制成固体培养基，倒平板。用接种环挑取一环培养液，在平板上划线，光照培养，待长出藻群落后挑取藻体继续划线，培养。在培养过程中镜检，直到在平板上长出单个藻群落，镜检为单种藻类为止。该方法可与稀释法结合应用。

1.3.4 离心分离法［4］

将培养液离心，不同种藻类虽都向离心管底部下沉，但由于其大小各不相同而以不同的速率下沉。因此，在离心的过程中，不同种的藻类可相互分离。镜检，选择某种藻类含量最多的沉淀物，再加入无菌水，继续离心，一直持续到可得到较纯的藻体。

1.3.5 毛细管分离法

主要工具是微细玻璃管。用微细玻璃管在中央部加热后拉长6～10cm，使口径缩小到0.008～0.16mm。拉长后的毛细管供吸取藻体用。在吸取时，要利用一小段较厚的橡皮管，一端套在吸管上，作为吸取藻体用。在压出藻体时，可直接利用吸耳球吹出。将吸入的藻体吹进装有培养基的小指管中进行培养。

1.3.6 小滴分离法［6］

用微量取液器进行操作，把与取液器配套使用的枪尖包扎灭菌备用；将欲分离的样品制成均匀的悬浮液并作适当稀释；用微量取液器吸取悬浮液，在无菌的载玻片上以纵横成行的方式滴数个小液滴，用显微镜镜检；当发现某一小滴内只有一种藻体时，用另一无菌枪尖将此小滴移入已灭菌的培养基内，经培养可能得到较纯的藻体。

1.3.7 pH值分离法

利用HGZ培养基适合多数藻类的生长这一特性，将其pH值调到3，4，5，6，7，7.5，8，8.5，9，将富集的藻类混合物接种到其中。在光照培养箱中培养。这种方法可以分离那些对pH值要求比较敏感的藻类。其中蓝藻多数适合生长在碱性水体中。

1.3.8 温度分离法

此法主要用于金藻和蓝藻的混合液。金藻对温度变化敏感，喜低温，在早春、晚秋大量繁殖。蓝藻一般喜欢较高的温度，在夏季、秋季大量生长。

将含有念珠藻和金藻的混合液放在水浴锅中，在温度42℃中分别培养6h，12h，18h，24h后，取出放入光照培养箱中培养。

金藻在42℃时停止运动，念珠藻也受到一定影响，但相对较小。

1.3.9 抑制剂分离法

利用的主要药品有：制霉菌素、苯菌灵、多菌灵等。

利用抑制剂对真核生物有作用而不影响原核生物的特性来分离蓝藻。

经试验观察，制霉菌素效果较好。

1.4 藻类保藏方法

1.4.1 液体保藏

用于保藏的培养液浓度比正常的培养液浓度高一倍。试管和三角瓶均可。

1.4.2 斜面保藏

制备琼脂培养基时，营养液浓度也比正常的培养液浓度高一倍，琼脂含量不宜过多，一般1～1.5%即可；斜面也不宜过大。用胶塞或棉塞依不同藻类而定。

1.4.3 固液双相保藏

在斜面保藏培养基中加入液体保藏培养基，液体没过斜面为宜。该培养基的优点在于培养液不易蒸发，可以较长时间保藏藻种。

1.4.4 补充说明

应用以上三种培养基保藏时，在接种后均需先放在适宜的光照与温度条件下，使藻种能够迅速增殖。在藻体的生长达到最大程度前，要把其转移到光线交暗、温度较低处。用纸遮盖，可防护棉塞不沾灰尘并减少蒸发。保存期间要不断分养。每一藻种的保存至少分三种不同年龄，最老的用于分养，其余两种备用。如固体培养物变干，可加入液体培养基继续培养。

2 讨论

2.1 分离纯化方法讨论

除已有的分离方法外，根据不同藻类的生理特性，又自行设计并试验了多种方法，如温度分离法、pH分离法、抑制剂分离法等，且效果较好，结果见表1。

HGZ培养基适合多数藻类生长，蓝藻生长最佳，例如念珠藻和席藻；水生104号含氮培养基＋葡萄糖适合大多数藻类的生长，如绿藻、金藻等；自制的硅藻培养基适合舟形藻的生长。平板划线分离法、毛细管分离法和小滴分离法均可与稀释法结合使用。培养过程中念珠藻和金藻混杂在一起，可用离心法进行分离，离心后念珠藻在下层，金藻在上清液中，去上清，加无菌水继续离心，一直重复至较纯，可用来分离单细胞的绿藻和金藻。pH分离法可用来分离念珠藻和席藻。HGZ培养基的pH调成碱性后，短时期内只有念珠藻和席藻可以良好生长，这样就可把其他种的藻类去除掉。注意要及时观察念珠藻和席藻的生长情况，时间过长，它们也会死亡。温度分离法主要适用于金藻和念珠藻的混合液中的念珠藻的分离。念珠藻耐高温，金藻喜低温，对温度变化敏感。苯菌灵、多菌灵属于农药类物质，对人体有害，并且它们对藻类的生长抑制性不强，不易采用。制霉菌素相对比较安全，而且对真核藻类的抑制效果比较明显，例如可以使金藻细胞裂解，可以杀死栅藻。这样，对于金藻和蓝藻或者栅藻和蓝藻的混合液中的蓝藻的分离就可在培养液中加入制霉菌素，可以分离出蓝藻。通常加入制霉菌素的量为0.3～0.4万单位／ml。

2.2 保藏方法讨论

由于需要长期存储，培养基要长时间供给藻体营养，所以保藏用的培养基的营养成分浓度都要较高，一般比正常培养基浓度高一倍。

表1 不同分离方法的比较

表2 几种藻种最佳保藏方法

栅藻在固体上生长细胞容易散落，分散成单个细胞，而在液体中则长势良好；在液相中保藏的纺锤藻由于生长过于旺盛，细胞形态变化很大，且容易衰老，色素体消失；金藻在斜面或有固体的双相培养基中不能正常生长，鞭毛脱落，细胞膨大，外观看变黄、粘稠，细胞死亡；舟形藻在自制的硅藻培养基中生长最好，由于舟形藻具壳，比较硬，又有游动的性质，因此在固体培养基中几乎不生长，所以用液体保藏；蓝藻门的三种：念珠藻、席藻都需要良好的通气条件，所以必须用棉塞 （试管）或纱布 （三角瓶）。念珠藻在固体培养基上生长，但是藻链变短，细胞变大，且生长缓慢；另外两种在固体培养基上几乎不生长。念珠藻在纯液体中生长太快，易衰老死亡，最长只能维持半个月时间；而在三角瓶中的固液双相保藏效果最佳，可以保藏数月。席藻在试管中用固液双相保藏效果最好，而在三角瓶的液体培养基中，生长迅速，藻丝聚集成团或者培养液变红，这都是衰老的标志。

保藏的藻种需要定期转接活化，除念珠藻需要短期就进行转接，一般三个月转接一次；其余藻种可保藏较长时间，一年转接一次即可。

3 小结

本实验对唐山市水源水和终端水中藻类进行富集培养、分离纯化。除已有的分离方法外，根据不同藻类的生理特性，又自行设计并试验了多种方法，如温度分离法、pH分离法、抑制剂分离法等，且效果较好。蓝藻分离可以采用培养基初步筛选法；平板划线分离法、毛细管分离法和小滴分离法均可与稀释法结合使用，分离单细胞藻类，如绿藻、金藻；温度分离法可以分离较耐高温的藻类，抑制喜低温藻的生长，从而达到分离目的。

同时探索各藻种的最佳保藏方法，保藏用的培养基的营养成分浓度都要较高，一般比正常培养基浓度高一倍。念珠藻、席藻等蓝藻适宜用固液双相培养基保藏；舟形藻、月牙藻、栅藻、金藻适宜用液体培养基保藏；另外保藏的藻种需要定期转接活化。

［1］张经浩.论藻类植物的经济价值及其对人类的意义 ［J］.安徽教育学院学报，2000，18（3）：79－81.

［2］房英春，苏宝玲.藻类与人类的关系 ［J］.特种经济动植物，2001，（12）：21.

［3］沈韫芬，顾曼如，施之心，等.微型生物监测新技术 ［M］.北京：中国建筑工业出版社，1991：146－147.

［4］华汝成.单细胞藻类的培养与利用 ［M］.北京：农业出版社，1986：272－356.

［5］朱浩然.植物制片技术学 ［M］.北京：人民教育出版社，1960.

［6］湛江水产学校.海洋饵料生物培养 ［M］.北京：农业出版社，1980.

Separation and Purification of Algae in the Fresh Water

WANG Mei-mei，XIONG Ya-nan，LIU Ai-hua，ZHANG Guang-ling
（Hebei Union University，Tangshan Hebei063000 China）

Taking the source water and end-pipe water in Tangshan Municipality as the experimental materials，we discuss the separation and purification of the algae in the fresh water.There are about nine methods，namely substrate screening method，dilution separation method，streak plate separation method，centrifugation separation method，capillary separation，drop separation，pH separation，temperature separation and inhibitor separation.The storing of the algae is also discussed in the paper.

algae；separation and purification；method

X83

：A

：1673－9655（2013）02－0118－04

2012－08－29

唐山市重点资助项目（12130211A）。

王梅梅 （1980－），女，衡水人。河北联合大学讲师。主要研究方向：淡水藻类。