广西奶水牛场隐孢子虫感染情况的调查

谢永平，魏晓瑞，李 军，陶 立，闭炳芬，韦志锋，彭 昊，陈泽祥，杨 威＊，王晓丽

（1.广西兽医研究所／广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）

水牛奶相对于其他品种的牛奶其营养价值更高，是适合人类饮用的高级营养食品［1］。近几年来，广西地方政府鼓励发展奶水牛业为重点产业，奶水牛存栏量大幅度增加。隐孢子虫（Cryptosporidi-um）是一种广泛寄生于人类、哺乳动物、禽类、爬行动物的寄生虫，可引起人和动物的腹泻，婴儿或免疫功能低下或缺陷者可因严重腹泻而死亡，畜禽动物也会因长期腹泻而影响生产性能［2］。目前，尚无对广西奶水牛隐孢子虫感染的报道，查明广西奶水牛隐孢子虫的感染情况具有兽医公共卫生安全意义。我国牛隐孢子虫病首次报道于1985年，由周圣文等在黑龙江调查发现了犊牛隐孢子虫病，随后在青海、甘肃、山东、安徽、河南、很多地区都对各地牛隐孢子虫的流行病学情况进行了调查报道，且感染率较高［3-5］。研究表明慢性感染隐孢子虫的奶牛会出现体重下降，产奶量减少，给奶牛业造成了很大的经济损失。国内外学者对隐孢子虫感染黑白花奶牛和农村散养役用水牛的情况已进行报道［6-8］，但对规模化养殖的奶水牛感染隐孢子虫的流行病学情况较少报道。为了查明广西奶水牛隐孢子虫的感染情况，笔者于2012年对广西主要规模化养殖奶水牛场进行了隐孢子虫感染情况的调查。针对广西奶水牛圈养放牧的饲养模式，应用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测了广西区8个奶水牛场1 009头份不同日龄的奶水牛新鲜粪样，应用形态学和PCR 方法对分离的卵囊进行虫种鉴定，该调查结果为广西奶水牛隐孢子虫病的防治提供参考，同时为兽医生物安全卫生提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 采集广西南宁、来宾、百色、北海、贵港、钦州6个市8个奶水牛场1 009头份奶水牛的新鲜粪便样品，其中1岁以下的牛344头份，1岁以上的牛665头份。每份样品采集50g左右，装在干净塑料袋里，登记编号，详细记录采集样品的时间，采集地区，日龄等，放置于实验室4℃冰箱待检。

1.1.2 试剂 饱和蔗糖溶液和改良抗酸染色液的配制参照陶立等［9］的方法。2×TaqPCR Master mix、DNA Marker为广东东盛生物科技有限公司产品。粪便基因组DNA 提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。

1.1.3 仪器 光学显微镜，PCR 仪。

1.2 方法

1.2.1 饱和蔗糖溶液漂浮法 每份粪样称取10g，加入适量自来水充分搅匀，分别经过60目铜丝筛和260目尼龙筛过滤，滤液分别放入编好号的离心管中3 000r／min离心10min，弃上清，加入适量配置好的饱和蔗糖溶液，充分搅拌，使下层沉淀和蔗糖液充分混匀，3 000r／min离心10min。用铁丝吊环蘸取表层液膜，涂于载玻片上，制片后于400×光学显微镜下测量观察。

1.2.2 改良抗酸染色法 取饱和蔗糖溶液漂浮法第一次离心后的粪便沉淀样品，搅匀后蘸取沉淀样品涂片，涂片自然干燥，甲醇固定8 min，滴加甲液染色5min～10min，水洗；滴加乙液脱色1 min～5min，水洗；滴加丙液复染1min～2min，水洗；晾干后于1 000×油镜下观察拍照。

1.2.3 隐孢子虫感染强度和卵囊形态学观察鉴定

显微镜下未见到卵囊的标记为“-”，每片中少于5个卵囊的记为“＋”，每个视野观察到1～5个卵囊的记为“＋＋”，每个视野有6～10个卵囊的记为“＋＋＋”，超过10个卵囊记为“＋＋＋＋”。每个玻片观察100个视野，在显微镜下仔细观察卵囊的形态并测量100个卵囊大小，根据卵囊的长短径值计算卵囊形状指数，结合观察到的卵囊的形态特征鉴定隐孢子虫种。

1.2.4 隐孢子虫种类的PCR鉴定

1.2.4.1 卵囊纯化的方法 隐孢子虫的卵囊纯化采用蔗糖密度梯度离心法，按照体积比，以饱和蔗糖液为母液分别配置1∶1、1∶2、1∶2.5、1∶5的处理液，取离心管先加入1∶1蔗糖液纯化，3 600r／min离心15min；收集卵囊液，以1∶2继续纯化收集卵囊；下层加入1∶2.5蔗糖溶液，中层加入1∶5蔗糖液，上层加入上一步纯化的卵囊液，3 600r／min离心15min，收集卵囊液用蒸馏水稀释后3 000r／min离心10min，收集沉淀加入重铬酸钾液保存备用。

1.2.4.2 卵囊DNA 的提取 取饱和蔗糖溶液纯化后的卵囊，水洗3次，洗去重铬酸钾后取200 mg样品，按照粪便基因组DNA 提取试剂盒的说明书，进行隐孢子虫卵囊的DNA 提取。

1.2.4.3 PCR鉴定 参照彭昊等［10］建立的方法进行隐孢子虫种类鉴定。PCR反应结束后将PCR 产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，对测序结果进行比对分析。

2 结果

2.1 广西奶水牛隐孢子虫的分离结果

通过检测来自广西8个奶水牛场1 009头份不同日龄的奶水牛新鲜粪样，其中1岁以下的牛344头份，1岁以上的牛665头份，仅发现1头奶水牛感染阳性，年龄在1.5岁左右，感染强度为“＋＋＋”，广西奶水牛隐孢子虫的感染率仅0.1%。

2.2 分离株卵囊的形态特征及鉴定

在显微镜下观察从奶水牛粪样中分离到的隐孢子虫卵囊，其囊壁薄，光滑，无微孔，无极粒，无色，卵囊内有月芽形的子孢子和1个残体。饱和蔗糖溶液漂浮过后的隐孢子虫卵囊呈玫瑰红色，周围有淡绿色的折光带，卵囊形状为长卵圆形（图1）。改良抗酸染色后的隐孢子虫卵囊为卵圆形，卵囊呈深玫瑰红色，卵囊对比分明。部分卵囊内可见到弯曲的子孢子，大部分卵囊内部子孢子为结构模糊的环状结构（图2）。卵囊（n＝100）平均大小7.58μm×5.30 μm（5.4μm～9.3μm×4.12μm～6.5μm），卵囊形状指数1.40（长／宽），与陶立等［13］报道的形态大小相似，可初步鉴定为安氏隐孢子虫（C.andersoni）。

图1 饱和蔗糖液中奶水牛隐孢子虫卵囊形态（400×）Fig.1 The morphology observation of Cryptosporidium oocysts in buffalo after Shether’s sugar flotation（400×）

图2 改良抗酸染色奶水牛隐孢子虫卵囊形态（1 000×）Fig.2 The morphology observation of Cryptosporidium oocysts in buffalo after modified acid-fast stain method（1 000×）

2.3 PCR鉴定结果

电泳结果显示，扩增出长度约为263bp的目的片段，与预期的安氏隐孢子虫扩增片段一致（图3）。PCR 产物送北京六合华大基因科技股份有限公司完成测序，测序分析结果显示此样品为安氏隐孢子虫（C.andersoni）。

图3 PCR 产物扩增结果Fig.3 Identification of PCR products

3 讨论

寄生于牛体的隐孢子虫有微小隐孢子虫（C.parvum），赖氏隐孢子虫（C.ryanae），安氏隐孢子虫（C.andersoni）和牛隐孢子虫（C.bovis）。安氏隐孢子虫主要感染青年牛和成年牛，导致产奶量降低，而其他症状不明显。国外水牛感染隐孢子虫的种类多为混合感染［11］。我国水牛隐孢子虫感染种类主要是微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫［3，10］。笔者通过调查检测广西8个奶水牛场1 009头份不同日龄的奶水牛新鲜粪样，仅发现1头奶水牛感染阳性，其卵囊通过分离纯化后，经形态学和分子生物学鉴定为安氏隐孢子虫（C.andersoni）。证实广西奶水牛感染了安氏隐孢子虫，但感染率很低。

El-Khodery S A 等［7，11］采用ELISA 或改良齐尼氏法对水牛隐孢子虫感染的检测结果表明，坦桑尼亚和埃及的水牛隐孢子虫病的感染率为14.0%～22.2%。孙涛等［5，8，12］采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测结果表明，合肥、河南等地水牛隐孢子虫病的感染率为1.8%～16.73%。笔者应用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法调查广西8个黑白花奶牛规模场1 731头份，隐孢子虫的感染率为13.7%；此次笔者应用相同方法检测广西8个奶水牛场的1 009头份奶水牛隐孢子虫的感染率仅0.1%，说明广西奶水牛隐孢子虫感染率很低，究其原因可能与饲养方式和养殖场的历史长短有关。广西奶水牛业是新兴产业，在调查的养殖场中，广西水牛研究所是广西唯一的奶水牛的保种和选育单位，其下属良种奶水牛场负责全区的奶水牛的供应，该场在2010年和2012年2次隐孢子虫调查检测中均为阴性；其他调查场都是近1年～2年才发展奶水牛养殖，场地新、环境卫生好；奶牛场都采取公司加农户的方式进行奶水牛推广养殖，农户饲养的奶水牛养殖数量少，易于管理，养殖与经济效益挂钩，农户责任心强，饲养管理和卫生条件做得更好更仔细。

隐孢子虫在人类中主要引起腹泻，尤其对于免疫功能受损的病人及免疫力低下的人群或儿童引起严重的渐进性腹泻，加速免疫低下或免疫缺陷病人的死亡。安氏隐孢子虫是人兽共患隐孢子虫种类之一［11］。隐孢子虫的感染途径主要是经过粪-口感染，因此人兽共患传播已成为隐孢子虫的重要传播途径之一［13］。文献报道水源性污染已成为人感染隐孢子虫的主要途径［14］，由于奶水牛饲养周期较长，易感性强，排出卵囊时间较长；而奶水牛又常在河边放养，患病奶水牛的粪便中含有大量感染性卵囊；可传播多种人兽共患的寄生虫卵囊，排入河流中，造成了当地的土源和水源性污染，可能引起人兽共患寄生虫的传播，对人类和家畜健康造成很大的威胁。因此，本研究调查广西地区奶水牛隐孢子虫的流行病学情况，分析当地感染的隐孢子虫种类和基因型，对有效预防和控制人和奶水牛隐孢子虫病的传播提供理论依据，对当地的人畜健康具有重要的公共卫生学意义。

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