正交设计优选痹痛贴提取挥发油的水煎液的除杂工艺

奚建，李建利

痹痛贴是由独活、川芎、肉桂、乳香、没药等药材经过提取、浓缩、成型等步骤制备的贴剂，具有活血化瘀，消肿止痛的功效，用于治疗各种痹症。方中独活为君药，其发挥镇痛、镇静和抗炎、解痉、抗血栓作用的主要物质基础主要为香豆素类化合物，川芎、肉桂等药材主含挥发油；乳香、没药[1]中发挥镇痛、抑制炎症、抗血栓等作用的物质基础主要为树脂成分。故笔者拟定了对方中川芎、肉桂等药材先提取挥发油，提挥发油后的药渣再与剩余药材乙醇回流提取的工艺。由于传统用药都是水煎，故提取挥发油所得水提取液也应作为处方药效成分，但由于水煎液多含有蛋白质、多糖、淀粉、黏液质等杂质，使药效成分含量降低，影响疗效；故本文主要对按试验优选出的最佳提取挥发油工艺后的水煎液进行除杂研究，采用乙醇沉淀法，以药液比、含乙醇量为考察因素，以醇浸膏收率和阿魏酸的含量为评价指标，通过正交设计表来安排实验，来优化最佳工艺。

1 仪器与试药

川芎、肉桂等药材购自四川科伦天然药业有限公司，经成都中医药大学卢先明教授鉴定，药材符合《中国药典》2010年版要求[2]，阿魏酸对照品（批号110773-200611）购自中国药品生物制品检定所），甲醇为色谱纯，纯净水(哇哈哈纯净水)，其余所用试剂均为分析纯。

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（SPD-20A 紫外检测器）；METTLER TOLEDO电子天平(AB204-E)。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸含量测定

2.1.1 色谱条件[2]色谱柱Kromasil C18（5μm，250×4.6mm）；流动相甲醇-0.1%醋酸水（35：65）；流速1.0 mL.min-1；柱温30℃；检测波长320 nm。

2.1.2 方法专属性考察 对照品溶液的制备 精密称取蛇床子素对照品适量，用甲醇溶解制成15μg/ml的溶液即得。

供试品溶液的制备 分别精密吸取各样品提取溶液5ml，挥干，用甲醇溶解，并定容至25ml容量瓶，取溶液适量微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得。

方法专属性 分别精密吸取蛇床子素对照品溶液，供试品溶液各15μL，分别注入液相色谱检测，阿魏酸对照品，供试品在9.5min左右出现阿魏酸吸收峰。

2.1.3 线性关系考察 精密吸取对照品（15μg/ml）溶液2、4、8、10、16μl，按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定。以进样量为横坐标，相应峰面积为纵坐标，计算回归方程为：Y=1E+06X-272621（r=0.9997）。结果表明阿魏酸在0.03～0.24μg之间有良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 精密吸取阿魏酸对照品溶液，重复进样5次，以蛇床子素峰面积计算，RSD为0.86%。

2.1.5 稳定性考察 精密吸取同一供试品5μL，分别在0，2，4，6，8，10 h测定峰面积，RSD为1.20%(n=6)，表明供试品在10 h内稳定。

2.1.6 阿魏酸含量测定 分别取“2.2”项下得到的9组供试品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，各精密吸取15μl，分别进样，测定峰面积，计算阿魏酸的含量。结果见表2。

2.2 正交试验

影响醇沉除杂效果的因素有药液含醇浓度，初始药液质量浓度和静置时间、醇沉次数等，参考相关文献[3]并结合预试验，并考虑到痹痛贴的提取工艺线路，选择药液含醇浓度和初始药液质量浓度为考察因素，并考虑两因素交互作用，按表2进行正交试验，以浸膏收率和阿魏酸的含量为评价指标。按L9(34)正交表进行设计。因素水平见表1。

表1 因素水平表

将提挥发油水煎液浓缩至一定的质量浓度，加入95%乙醇使药液中乙醇达到一定浓度值，冷藏24小时，抽滤，滤液回收乙醇后定容至100mL，即得得1～9号样品溶液，测定含量。分别吸取定容后的样品溶液20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，取出，迅速称量，计算浸出物得率。结果见表2。

浸出物得率=醇沉后浸膏质量/初始浸膏质量×100%

表2 正交试验结果及计算表

表3 醇浸膏方差分析

表4 阿魏酸含量方差分析

2.3 结果分析

以浸膏得率为考察指标，各因素作用主次为B＞A，方差分析表明B因素有显著性影响，A×B无显著性影响，说明A与B无交互作用，醇沉后浸膏率以少为宜，故以A1B3为佳。以阿魏酸含量为考察指标，各因素作用主次为A＞B，方差分析表明均无显著性影响，以A1B2为佳。考虑到阿魏酸含量的重要性，故最后选择A1B2，即初始药液质量浓度为1.0～1.10g/ml，加95%乙醇醇沉，使含醇量达70%。

2.4 验证试验

按确定的除杂工艺进行平行3次验证试验，结果3次试验浸膏得率分别为14.08%，14.13%，14.16%，平均值为14.12%；阿魏酸含量分别为2.03，2.32，2.45mg，平均值为2.27mg。表明该提取工艺稳定、可行。

3 讨论

本实验优选的痹痛贴水提取液最佳醇沉工艺为初始药液质量浓度为1，加95%乙醇醇沉，使含醇量达70%，在此工艺条件下, 阿魏酸的含量较高和浸出物得率适中；对于影响乙醇醇沉的因素中，初始质量浓度过高的药液黏稠度高, 难以与乙醇充分接触,析出的沉淀易包裹药液而造成有效成分损失；初始质量浓度过低则药液量大, 耗费乙醇, 延长时间。因此选择了1.0～1.10g/ml，1.10～1.15g/ml，1.15～1.20g/ml三个范围的初始质量浓度为考察指标；对于药液含醇浓度，浓度太低，乙醇用量大浪费，回收不方便，且沉淀成絮状，难以下沉，效果差；浓度太高，得到的醇提液较少，沉淀中含有大量的有效物质，且加入高浓度乙醇，易造成局部浓度过高，形成大块沉淀，将有效成分包裹，随沉淀除去，并参考相关文献[3]，选择药液含醇量分别为50%、60%、70%三个水平考察对所测指标的影响。另外预实验对醇沉次数的研究表明，醇沉次数并无显著影响，且从简化工艺、节约生产成本选择醇沉一次。

[1] 徐艳.乳香、没药的炮制使用[J].安徽预防医学杂志,2004,10(5):317.

[2] 中国药典.一部[S].2010:38,127.

[3] 玄律,倪健.多指标优选醒目颗粒水提醇沉制备工艺[J].中成药杂志,2010,32(7):1238.