代谢组学应用于中药制剂各关键环节的研究概况及思考

卢君蓉，何瑶，傅超美，胡慧玲，王战国，刘芳

中药制剂具有悠久的历史，在中医药防病治病方面发挥了积极的作用，其起源可追溯至夏禹时代（公元前2140年），那时已有药酒，商汤时期（公元前1776年），总结写成《汤液经》，是我国最早的方剂与制剂技术专著，并且汤剂至今仍应用于临床[1]。近现代以来，随着科学技术的进步和检测手段的更新，中药制剂的剂型更加丰富，质量控制标准也不断提高。如2010年版《中国药典》收载灯盏花素注射液、复方丹参滴丸等新剂型及新的给药途径，在制剂质量控制方面，广泛应用了高效液相色谱法（占全部制剂品种的90.2%）[2]，并首次引入指纹图谱技术到制剂质量控制中，更好地体现了中药的整体性[3]。但是，目前中药制剂的质量控制主要体现在对其中的一个或几个成分，中药制剂的特征指纹图谱主要反映制剂中具有共性的化学信息，对于差异性成分的体现不足。

代谢组学属于系统生物学的范畴，能够及时、灵敏地对所有代谢产物进行定性和定量分析，具有整体性、动态性和综合分析的特点[4,5]，不仅能反映中药制剂中的共有信息，还能够推断差异存在的原因，与中医药防病治病的整体观念不谋而合。本文总结了代谢组学在中药制剂各关键环节的已有研究基础，结合课题组的前期研究，提出将代谢组学应用于中药制剂研究和中药制剂质量全方位控制的研究思路，以期为创新中药开发和完善中药制剂的质量标准提供一定的参考。

1 代谢组学应用于中医药研究的概况

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法，主要包括metabonomics和metabolomics两个方面，在研究植物生理代谢网络时主要使用metabolomics的概念[6]，植物代谢组学主要研究外界因素变化对植物所造成的影响，是物种表型分析最强有力的工具之一[7]。而在药物研发和疾病研究等领域，以动物体液或组织样品为研究对象的，则用metabonomics较多，动物代谢组学所关注生物体系受环境刺激或基因修饰所产生的所有代谢产物的变化，并通过分析体液代谢物组成来确定生物体系的系统生化谱和功能调控规律[8]。其主要的研究平台有核磁共振技术（NMR）、液相色谱-质谱技术（LC-MS）、气相色谱-质谱技术（GCMS）等[9]。

由于代谢组学具有高通量、整体分析等特点，故将代谢组学技术和理念应用于中药制剂的研究中，能更有利于尽快阐明中药“多组分”对复杂生物系统“多靶点、整体调节”作用的科学内涵[10]。已应用于中医证候[11]、针灸[12,13]、中药及中药制剂防病治病的配伍规律、物质基础、作用机理、安全性评价等领域[14～21]。

2 代谢组学在中药制剂各关键环节中的应用

运用代谢组学的方法与理念，结合多元数据统计软件，我们课题组及其他药学工作者对中药制剂各关键环节开展了相关探索与研究，取得了较好的成绩。

2.1 代谢组学在中药制剂的投料环节的应用

投料是中药制剂生产的关键环节之一，2010年版《中国药典》规定中药制剂处方中的药味和临床配方必须采用中药饮片，中药经过炮制可改变药性、达到增效减毒的目的，严格控制原料的质量对中药制剂生产的后续环节和成品质量意义重大。课题组采用HPLC-UV代谢组学技术对川木香煨制前后的化学成分进行对比研究，采集川木香生品和煨品的HPLC-UV色谱图信息，通过代谢组学技术对样品进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）和权重矩阵的等级聚类分析（HCA），结果表明，代谢组学技术可以将川木香生品和煨品区别开，数据显示二者的化学成分存在显著的量变，其中有 7个成分与二者的差异性密切相关，包括主要药效成分木香烃内酯和去氢木香内酯[22]。课题组首次以代谢组学技术，借助于LC-TOF-MS手段，对7个省区19个产地的厚朴药材建立了代谢组学方法学评价体系，用此体系得到了13个影响不同产地厚朴质量差异的色谱峰，并借助于质谱图初步推断了其中10个成分；首次用代谢组学技术，对10批同一产地未“发汗”和“发汗”药材样品进行了评价，结果表明，代谢组学技术能将未“发汗”品和“发汗”品区别开来，影响未“发汗”品和“发汗”品药材质量差异的主要是4个色谱峰，借助于质谱图初步推断了其中3个成分，分别是：阿西米洛宾、厚朴三酚B、6’-O-甲基和厚朴酚[23]。有学者[24]运用基于NMR和UPLC的植物代谢组学技术对远志不同炮制品（生远志、蜜远志及甘草制远志）进行分析，指认其中的初级代谢产物21个，次级代谢产物8个，并对三种炮制品中的远志皂苷含量进行测定，结果从代谢组学整体角度表明，生远志与蜜远志、甘草制远志的化学成分差异明显，说明炮制可改变药性，导致功效上的差异。通过对中药材（生品、炮制品）的代谢组学研究，可以更好的保证中药制剂投料的质量，为生产质量稳定、疗效可靠的中药制剂奠定基础。

2.2 代谢组学在中药制剂的中间体环节的应用

采用代谢组学技术，可以从中药制剂中间体的化学信息和药效信息等多方面评价其质量，从而很好地控制中药制剂中间体的质量。课题组在前期引入多成分的测定方法，建立应用小粒径色谱柱同时、快速测定红景天（蔷薇红景天）提取物中红景天苷、酪醇、络赛维的HPLC方法，更好评价不同厂家提取物质量差异的基础上，采用代谢组学的方法，结合LC-MS对红景天提取物的质量进行评价，共成功分离和检测到红景天提取物中131个峰，并采用主成分分析法（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）和权重矩阵的等级聚类分析法（HCA）对结果进行分析，通过代谢组学的方法分析得出结果，不同红景天提取的质量差异主要体现在6个成分，其中络赛维的含量对红景天提取物的质量影响较大[25,26]。说明基于液相色谱的代谢组学在中药提取物的质量评价方法具有很大的潜力。同时，有学者[27]采用超高效液相色谱串联质谱( UPLC-MS /MS) 技术对正常对照组、骨质疏松模型组、骨碎补给药组大鼠尿液代谢物谱进行分析测定，发现了肌酸酐、色氨酸、苯丙氨酸、甲酚硫酸盐、柠檬酸、壬二酸等9 个潜在的生物标志物。与正常对照组相比，模型组大鼠尿液中肌酸酐、柠檬酸、壬二酸、马尿酸、色氨酸以及吲哚硫酸盐含量显著下调；苯丙氨酸、甲酚硫酸盐及苯乙酰甘氨酸含量显著上调，说明骨碎补醇提物可以调节骨质疏松大鼠的体内代谢紊乱，且其作用机制可能与调节能量代谢、肠道菌代谢、氨基酸代谢以及抗氧化损伤有关。还有学者[28,29]分别对银杏提取物、知母提取物的药效等进行了代谢组学研究。

2.3 代谢组学在中药制剂成品环节的应用

2.3.1 代谢组学在中药制剂成品的化学信息评价方面的应用 课题组运用代谢组学的技术对银杏叶片质量评价进行了研究，采用HPLC-UV 法检测12 个厂家生产的银杏叶片的水解或未水解样品中的大部分化学组分，色谱数据经过对齐处理与归一化处理后，由SIMAPCA-P+12.0 软件进行多变量数据分析，据此评价银杏叶片的总体质量差异。结果显示，无论水解与否，不同厂家的样品的综合质量均存在显著的差异；山奈酚与另一未知成分对样品整体质量差异贡献较大。结果表明，12 个厂家生产的银杏叶片总体综合质量差异较大，应针对性地制定更加完善的质量标准以加强其质量控制[30]。有学者[31]采用代谢组学的方法对中药四逆汤的化学物质组进行了研究，采用 HPLC-DAD-TOF/MS 技术对四逆汤中的化学成分进行分离鉴别和结构解析，并对四逆汤给药后大鼠血浆中的吸收成分和代谢产物进行了辨识。结合数据库匹配技术和动态调节TOF/MS 碎片电压的方法，在四逆汤中共鉴别了 53 种化学成分，包括24 种生物碱，12 种黄酮，13 种皂苷和 4 种姜辣素类化合物，在灌胃给予四逆汤的大鼠血浆中筛选鉴定了 33 种血清活性成分和 5 种代谢产物，本研究为四逆汤的代谢和药效研究奠定了基础。通过运用代谢组学技术，对中药制剂成品中的化学信息进行综合评价，可以更加全面的规范中药制剂的质量，为中药制剂的质量控制提供新的模式。

2.3.2 代谢组学用于中药制剂物质基础研究 中药制剂所含成分较多，结构多样，常常难以用一个或几个成分表征其防病治病的真正物质基础，故对中药制剂的质量评价研究应强调整体性。代谢组学将高通量活性筛选技术与中药制剂物质基础研究相结合，能够快速获得中药制剂的物质基础[32]。有学者[33]以四物汤为例，采用体外生物活性介导的药代动力学方法研究如何更好地控制中药质量。主要包括以下五个步骤：（1）运用数据分析挖掘四物汤的活性成分；（2）对四物汤制剂的活性成分进行定量研究；（3）模拟体外胃肠环境，测定四物汤有效成分在体外的分布与代谢情况；（4）鉴别四物汤在体外Caco-2模型细胞中可吸收和代谢的成分；（5）测定这些成分的稳定性。结果表明，不同四物汤产品中有效成分的含量有较大的差别，在数据挖掘中得到的9个有效成分有3个可以很好的被吸收并且可保持3个月以上的稳定性。《中国药典》所规定的四物汤质控成分芍药苷的透过性和稳定性较差，不适合作为四物汤的主要质控成分。其研究方法可以为中药制剂物质基础研究提供有用的途径。

2.3.3 代谢组学用于中药制剂作用机制研究 代谢组学所测定的对象是内源性的物质，将其运用于中药制剂作用机制的研究中，可以更好地获得和评价中药制剂进入体内后的整体内源性物质和生物标志群情况，深入挖掘作用机制。学者[34]对复方丹参片血清药物化学及代谢组学进行了研究，利用快速液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（RRLC-Q-TOF/MS），检测复方丹参片的入血成分和代谢产物，建立并比较给药前后大鼠的代谢指纹图谱；利用超高压液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS），鉴定心肌缺血的生物标志物，建立并比较造模前后大鼠的代谢指纹图谱；并进一步研究和比较五种常见西药与复方丹参片及其有效成分对心肌缺血大鼠的保护作用，通过中西药对比的方式，初步阐释了复方丹参片及其有效成分（丹参酮ⅡA、丹参酚酸 B）治疗心肌缺血的作用机制。还有学者[35,36]分别做了四物汤对环磷酰胺所致血虚证治疗后的代谢组学研究和四物汤对辐射致血虚证小鼠作用的代谢组学研究，从不同的角度对四物汤的作用机制进行了探讨。

2.3.4 代谢组学用于中药制剂安全性评价研究 运用代谢组学的方法可以分析中药制剂尤其是含有毒成分的中药制剂进入体内后的内源性代谢物的变化，研究不同代谢路径的化合物以表征服药对机体的改变和损伤，从而评价中药制剂的安全性。目前，代谢组学的方法已经运用到对单味中药的安全性评价中，如学者[37]对广防己、粉防己的肝肾毒性及代谢组学进行了比较研究，采用NMR技术测定分析给药后血、尿中的各项指标。结果显示，广防己、粉防己组大鼠尿液中主要变化代谢物有柠檬酸，2-酮戊二酸、牛磺酸、马尿酸盐、TMAO、肌酐；血液中主要变化代谢物有不饱和脂肪酸、3-羟基丁酸、丙酮、乙酰乙酸、肌酐、NAC、OAC。结果说明广防己、粉防己均可引起肝、肾损害，且随给药时间延长损伤加重；粉防己的肝、肾毒性较广防己重。还有学者[38]运用代谢组学的方法对附子的炮制品黑顺片的毒性进行了研究，采用NMR技术分析和测定大鼠灌胃给予黑顺片煎液后的尿液和血浆中的牛磺酸、琥珀酸和马尿等成分，结果表明，黑顺片对大鼠的心脏毒性具有剂量依赖性。据笔者不完全统计，在2010年版《中国药典》内共收录了含有草乌、川乌、附子及其炮制品、马钱子等有毒中药的制剂品种约达60种之高[39]，若将这种研究思路和方法可以借鉴到中药制剂的安全性评价中，如采用代谢组学的方法对含乌头属类原药材的中药制剂人参再造丸、三七伤药片、三七血伤宁胶囊等质量进行深度评价，可以更好地保证中药制剂的安全可靠。

3 问题与思考

3.1 本文所述将代谢组学的方法应用于中药制剂各关键环节的研究综合了植物代谢组学[40]和动物代谢组学两个方面，主要从整体的角度对中药制剂研究的原药材投料、中间体、成品的各个环关键环节进行高通量、无偏差的全面分析，与中医药防病治病的整体观相吻合，能够更加全面地评价中药的整体质量，在中药研究方面具有强大的生命力。但是由于外源性成分容易干扰，检测所需的仪器设备价格昂贵、对操作人员的专业性要求高，并且代谢组学分析数据量巨大，挖掘其中的关键信息并进行降维处理仍是代谢组学研究的一个技术瓶颈。国内外对于代谢组学的研究多停留在模式判别与生物标记物的鉴定层次，对于其生物学意义挖掘不够，故建议应进一步完善代谢组学的评价方法与理论体系，重视与经典研究方法以及新的评价方法如生物活性评价、药效学等方法和结果的衔接和结合，同时还应注重中医药理论的指导[41～44]，逐渐完善中药制剂的质量评价体系。

3.2 课题组在前期研究中，运用代谢组学技术对原药材川木香、厚朴，红景天提取物以及银杏叶片制剂进行研究，并取得一定的成绩。但是所研究的原药材、提取物和成品间相对独立，研究成果相对分散，未能充分体现代谢组学在中药制剂研究中的真正优势。课题组在今后研究中，将在已有的基础上，充分挖掘组方配伍和经典方剂信息，深入具体制剂品种进行系统研究，构建基于代谢组学的中药制剂研究新模式。

3.3 中药具有多成分、多层次的复杂特性，研究中药制剂必须注重整体观念。代谢组学所具备的全面评价内源性代谢物等特点决定其在中药现代化研究方面具有很大的潜力[45]。基于我们课题组在前期研究中对中药制剂原药材、中间体、成品的研究以及相关药学工作者的研究成果，我们认为采用代谢组学技术，研究并评价中药制剂研究过程中“原药材”——“中间体”——“成品”等各关键环节的思路和方法，可以有利于从系统生物学和整体观的角度开展中药制剂研究，完善中药制剂的质量标准体系，全面的提高中药制剂的质量。希望可以为中药制剂的研究提供新的思路，为中药制剂突破现有瓶颈提供参考。

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