家蝇取食粗纤维后β－葡萄糖苷酶活性与基因表达量的变化

张 姝，胡 蓉，吴建伟，国 果，付 萍

(贵阳医学院人体寄生虫学教研室，贵阳 550004)

β－葡萄糖苷酶(β－Glucosidase，EC，3.2.1.21)是纤维素酶重要组成部分，能催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖，可以消除纤维二糖对纤维素酶的负反馈作用，在农业副产品的降解、利用过程中发挥着关键作用(Anish et al.，2010;James et al.，2010)。关于昆虫利用自身β－葡萄糖苷酶降解环境中纤维素以获得生存所需能量的研究，国内外已有大量的报道。研究对象多以等翅目的白蚁(Nathan et al.，2011;曾文慧等，2012;Tokuda et al.，2012;刘瑞娴等，2012)、鞘翅目的天牛和象鼻虫(殷幼平等，2000;Yapi et al.，2004;Wei et al.，2006;索风梅等，2007)、鳞翅目的草地贪衣蛾(Marana et al.，2004)等为主。但对于分布广泛，繁殖力超强，杂食类的家蝇Musca domestica却未见相关报道。家蝇是生态系统中的分解者，在一定条件下，蝇蛆能够食用高粱秸秆、稻草秸秆等农副产品下脚料为自身提供能量。本研究以家蝇为研究对象，用粗纤维含量不同饲料进行喂养，观察家蝇不同生长发育时期的β－葡萄糖苷酶mRNA 表达水平和酶活性变化，探讨食物中粗纤维含量对β－葡萄糖苷酶的影响。为揭示家蝇对自然界纤维素的生物转化作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验昆虫

家蝇由贵阳医学院人体寄生虫学教研室保存。养蝇房恒温25℃，光周期12L∶12D，将家蝇分为3组，对照组以麦麸喂养，粗纤维含量为30%，实验组1 用等量的高粱秸秆代替麦麸，粗纤维含量为40%，实验组2 等量稻草秸秆替代麦麸，粗纤维含量为50%。

1.1.2 主要试剂

水杨苷(Sigma)，非干扰型蛋白浓度检测试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，3，5－二硝基水杨酸(DNSA，Genview)，总RNA 提取试剂盒Trizol(Invitrogen)，Prime Script®One Step RT－PCR Kit、DNA maker、反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ、pMDTM18－T(TaKaRa)。

1.1.3 主要仪器

实时荧光定量PCR 仪(ABI7300)，凝胶成像系统(美国Bio-rad)，CT15RE 高速冷冻离心机(HITACHI)，752N 紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，μ-Quant 酶标仪(美国Bio-Tek)。

1.2 方法

1.2.1 饲料残渣中粗纤维含量测定

按照中华人民共和国国家标准GB/T 5009.10－2003 方法，检测对照组、实验组1和实验组2三种饲料残渣中粗纤维含量，同时对比饲养后家蝇3龄幼虫个体体重、体长以及幼虫主要成分。家蝇幼虫中粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、水分、灰分和碳水化合物的含量检测委托贵州师范大学分析测试中心(计量认证许可证:2009240425Z)依据中华人民共和国国家标准GB/T5009.3;.4;.5;.6;.10－2003 进行检测。

1.2.2 家蝇样品的采集

在对照组、实验组1和实验组2 中，按照文献方法(张姝等，2013)，分别在家蝇不同发育阶段(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫)取样，待用。

1.2.3 家蝇样品总RNA 提取

将家蝇不同样品采用Trizol 法提取样品的总RNA，用酶标仪对提取的RNA 进行测定，计算OD260nm/OD280nm比值和RNA 浓度。总RNA 用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。采用DL2000 DNA maker 作为指示。

1.2.4 反转录cDNA

按照TaKaRa 试剂盒说明书进行操作，反应体系为:1 μg 总RNA，2μL 5×gDNA Eraser Buffer，1μL gDNA Eraser，用RNase Free ddH2O 定容至10μL，42℃2 min 后，加入4μL 5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)，1μL Prime Script RT Enzyme Mix，1μL RT Primer Mix，4μL RNase Free ddH2O，37℃15 min，85℃5 s，－20℃保存备用。

1.2.5 RT－PCR

引物参照GenBank 上已发表的序列，采用primer 5 设计引物(跨内含子)，引物序列见表1。引物委托上海生工公司合成。50μL反应体系为:2μL Prime Script 1 step Enzyme Mix，25μL 2×1 step Buffer，1μL目的基因的上、下游引物，2μL Template RNA，19μL RNase Free ddH2O，ddH2O代替RNA 模板作为阴性对照。反应条件:50℃30 min;94℃2 min;94℃30sec，58℃30sec，72℃1 min，30个循环，终止延伸。扩增结束后，将5μL PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测和鉴定，用100bp DNA maker 作为指示。并用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后。连接到pMDTM18－T，然后转化E.coli DH5α 感受态细胞。进行蓝斑筛选，挑取阳性克隆接种于LB 液体培养基，过夜培养后用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA，将质粒送上海生工测序。

1.2.6 实时荧光定量PCR

25μL PCR反应体系:目的基因的上下游引物各1μL，cDNA 模板2μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ(2X)12.5μL，RNase Free ddH2O 8μL，ROX Reference Dye(50×)0.5μL。反应条件为:95℃30 s，95℃5 s，60℃30sec，40个循环。每一个样品3个技术重复，每组做3个生物重复。每次PCR反应均设置阴性对照(ddH2O代替cDNA 模板)。采用比较2－△△CT法，对目标基因进行相对定量分析。

表1 PCR 的引物Table 1 The primers of PCR

1.2.7 DNSA 法检测β－葡萄糖苷酶活性

1.2.7.1 粗酶液的制备

按0.15 g 样品加入1mL 0.1 M 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH=5.6)，冰浴研磨，在12 000 rpm，4℃，离心10 min，取上清液即为纤维素酶的粗酶液，置于－80℃冰箱中待用。

1.2.7.2 粗酶液蛋白定量

采用BCA 蛋白浓度测定法进行测定(Smith et al.，1985)。取10μL 家蝇粗酶液和6种不同浓度的蛋白质标准溶液加入2mL 的BCA 工作液，在480 nm 波长处测定其吸收值，计算出粗酶液的蛋白浓度。

1.2.7.3 DNSA 法检测家蝇β－葡萄糖苷酶酶活性

采用DNSA 法测定(Miller，1959)，在离心管中分别加入1% 水杨苷0.3mL 后加入粗酶液0.1mL，混匀后在50℃水浴条件下反应60 min，立即加入0.3mL DNSA 显色剂终止反应，在沸水浴显色5 min，冷却至室温后，用0.1 M 醋酸－醋酸钠缓冲液定容至5mL。于紫外分光光度计测OD540值，每一个样品3个生物重复，每组3个重复。每次酶活性实验均设阴性对照(以缓冲液代替粗酶液)。从葡萄糖标准曲线计算葡萄糖含量。在pH 5.6、50℃反应60 min 的条件下，以每分钟产生1 umoL 葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活性单位(IU)。纤维素酶活性大小用比活力(Willis et al.，2010)，即每mg 蛋白中的酶单位数量来表示。纤维素酶比活力(IU/mg)=(m×5.56)/(V×C×t)。m:产生的葡萄糖含量(mg);C:粗酶液蛋白浓度(mg/mL);V:反应液中加入的粗酶液体积(mL);t:反应时间(min)。

1.2.8 统计学分析

用SPSS11.5 软件对相关数据进行统计学分析，组间比较用q 检验，P＜0.05 为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 饲料残渣中粗纤维含量测定

饲料残渣中粗纤维测定结果显示，对照组、实验组1和实验组2 粗纤维含量为12.93±0.85%和16.4±0.41%，17.43±0.28%。对照组、实验组1和实验组2 的粗纤维降解效率分别为29.569±0.02%，39.59±0.009 %，49.65±0.41%。

2.2 家蝇幼虫的基本情况

由表2 可见，对照组和实验组饲养的家蝇3龄幼虫平均体重分别为26.7±1.2 mg、25.0±0.6 mg和26.3±0.8 mg，平均体长分别为11.7±0.7 mm、11.5±0.6 mm和12.1±0.7 mm，3 组间幼虫平均体重和体长两两比较无显著差异(P＞0.05)。3 组家蝇3龄幼虫主要成分检测情况见表2，实验组1和实验组2 的家蝇幼虫所含的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维含量都接近或大于麦麸饲养的家蝇幼虫。

表2 家蝇3龄幼虫主要成分比例Table 2 The main component ratio of the 3rd instar larvae from Musca domestica

2.3 RT－PCR 产物

将5 μLPCR 产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。结果表明，各模版扩增的内参基因GAPDH片段亮度相近，在209 bp 出现特异性条带，与理论值一致，测序得到的核苷酸序列，与目标序列一致。阴性对照无扩增条带出现。3 组各生长发育阶段的家蝇β－葡萄糖苷酶基因在188 bp 处均出现了特异条带(图1)，大小与理论值一致，各条带亮度存在差异。条带亮度明暗顺序为:卵＜1龄幼虫＜2龄幼虫＜龄幼虫＜蛹＜雌蝇≤雄蝇。阴性对照无扩增条带出现。

2.4 家蝇β－葡萄糖苷酶基因mRNA 表达水平

以GAPDH 基因作为内参，采用2－ΔΔCT法对不同组家蝇β－葡萄糖苷酶基因在家蝇各生长发育阶段的表达差异进行分析(图7)。在家蝇的6个生长阶段中家蝇β－葡萄糖苷酶基因均有表达，表达量呈逐步增强趋势(P＜0.05)，其中对照组、实验组1和实验组2 在成虫期表达水平最高，较卵期分别上调了约19倍，22倍，25倍。在不同粗纤维含量3个组中，家蝇β－葡萄糖苷酶基因表达量两两比较有显著差异(P＜0.05)，且实验组2＞实验组1＞对照组。实验组1和实验组2 在不同生长时期mRNA 表达水平较对照组分别提高了1.7～2.4倍，3.1～5.0倍。

2.5 β－葡萄糖苷酶酶活性的变化

2.5.1 粗酶液蛋白样品的浓度测定

根据蛋白定量试剂盒说明书，读取不同浓度的蛋白标准品BSA 吸光度值，得到各待测粗酶液的蛋白浓度(表3)。

2.5.2 β－葡萄糖苷酶活性检测

通过DNSA 法检测到3个组在家蝇不同生长阶段均具有降解水杨苷产生葡萄糖的能力，酶活性高低的顺序均为1龄幼虫期＞2龄幼虫＞3龄幼虫＞蛹期＞卵期＞成虫期。β－葡萄糖苷酶活性见图10。如图所示，实验组1和实验组2 在个体发育的不同阶段β－葡萄糖苷酶活力较对照组都有提高趋势，其中实验组2 的β－葡萄糖苷酶活力最高，酶活性水平较对照组提高了1.19～2.25倍。实验组1 的酶活性水平较对照组提高了1.04～1.37倍。

3 结论与讨论

表3 粗酶液蛋白浓度(mg/mL)Tab 3 The protein content of crude enzyme solution

图3 家蝇个体发育不同阶段β－葡萄糖苷酶活性Fig.3 BG activity from Musca domestica in different development stage

我国有丰富的秸秆资源，年产量可达7 亿多吨，居世界之首(梁榕旺和徐淑莉，2011)。这类物质多处于植物成熟后阶段，粗纤维含量很高，在31%至55%之间，受其细胞壁成分木质化的限制，因而秸秆在直接利用上受到了限制(Tawfik and Salem，2012;刘强，2010)。因此利用昆虫对农业副产品进行资源化处理已经成为当今可持续发展的一个重要思路(张文庆等，2008)。采用农作物副产物秸秆养殖昆虫，首先是变废为宝，将垃圾变成动物蛋白饲料，以促进其它经济动物的生长发育，其次是改善农业环境，把对人和环境的危害，降低到最低甚至为零。如水虻科的黑水虻，拟步甲科的黄粉虫都已被确定为一种重要的饲用资源昆虫，在动物蛋白饲料生产、转化农业废弃物方面得到应用和推广(柴志强等，2012;黄详财，2008)。家蝇为最常见的昆虫之一，也具有强大的生态转化的作用，可将生活垃圾、麦麸、谷糠、发酵的农作物秸秆等快速转化为蛋白质，被国际上列为新型蛋白资源昆虫之首(Moon et al.，2001;Yadav and Garg，2011;Zhang et al.，2012)。

β－葡萄糖苷酶又称β－D－葡萄糖苷水解酶，属于纤维素酶类，其作为纤维素酶系中关键的限速酶，是调控昆虫降解纤维素能力的重要因素。目前对β－葡萄糖苷酶研究多集中在对酶活性和体外的克隆表达的研究(Zhang et al.，2012.;Tokuda et al.，2012;Uchima et al.，2011;Ferreira et al.，2001)，尚未见对昆虫在不同发育阶段、不同生理状态下β－葡萄糖苷酶基因表达水平和酶活性的变化趋势报道。因此本实验借助实时荧光定量PCR 技术，分析不同生长发育阶段、不同食物环境下家蝇β－葡萄糖苷酶表达特点和变化趋势，揭示家蝇在不同生理状态下对食物中纤维素的利用情况，为降解纤维素的调控因素提供了一些实验依据。

本研究以不同粗纤维含量的饲料喂养家蝇，结果显示粗纤维含量的变化对家蝇的生长发育无影响，家蝇身体状况和品质与常规麦麸饲料喂养无差异(P＞0.05)。在诱导后和正常生长条件下，均有β－葡萄糖苷酶在家蝇体内广泛存在，其随着饲料中粗纤维含量增加表达水平也随之增加。在粗纤维含量为40%，家蝇降解粗纤维效率提高到39.59±0.009 %，家蝇β－葡萄糖苷酶基因表达较对照组提高了1.7～2.4倍;在粗纤维增加到50%，家蝇降解粗纤维效率提高到49.65±0.41%，家蝇β－葡萄糖苷酶表达增加较对照组提高了3.1～5.0倍。采用DNSA 法对家蝇β－葡萄糖苷酶活性的检测发现，3个组在不同生长发育阶段都具有β－葡萄糖苷酶活性，β－葡萄糖苷酶活性大小的顺序与家蝇β－葡萄糖苷酶基因mRNA的表达水平是一致的。因此推测家蝇在复杂生存环境条件中，是通过提高自身β－葡萄糖苷酶表达得以补充营养和能量来源，以维持机体的正常生长和发育。这与黄详财的报道相似(黄详财，2008)。同时本研究发现β－葡萄糖苷酶活性的变化没有其mRNA 的变化显著，推测是由于基因的表达包含转录和翻译两个层次，它们在发生的时间、位点存在着时空差异，而转录后又有转录产物的降解、翻译以及翻译后加工、修饰等好几个层面，比基因转录更加复杂，因此转录水平与蛋白表达水平并不完全一致。

家蝇个体发育不同阶段β－葡萄糖苷酶基因表达及其活性检测结果提示发育过程中β－葡萄糖苷酶基因表达可能与家蝇维持正常生理功能有关。β－葡萄糖苷酶基因在家蝇卵期缺乏转录活性，考虑其表达产物是母源性转录产物，所检测到的可能是母体的遗留，故呈低水平表达。幼虫期是家蝇迅速生长的时期，生长代谢较为旺盛，需要更多的营养物质提供其生长发育，因此β－葡萄糖苷酶作为降解纤维素、提供能量最为重要的效应分子，其表达的水平也呈现上调趋势，蛹期尽管是相对静止的虫态，但为了适应破蛹后复杂环境，仍然延续了幼虫期β－葡萄糖苷酶活性的增长。β－葡萄糖苷酶在成虫期达到最大转录活性，可能由于家蝇的不断生长发育，其降解纤维素系统也在逐渐完善，另一方面这个时期也是家蝇活动范围最大的时期，它们的新陈代谢以及生长发育都受到周围环境的直接影响，需要尽可能的利用环境中的纤维素以提供必须的营养。这与研究人员报道(黄详财，2008)，不同龄期的黄粉虫幼虫体内的纤维素酶活性随着龄期的延长逐步提高相一致。由此可见，家蝇β－葡萄糖苷酶活性的高低与其个体发育有着密切的关系。

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