糖皮质激素诱导A549细胞11β－羟基类固醇脱氢酶1型选择性启动子的使用＊

韩岩岩

(遵义医学院公共卫生学院，贵州遵义 563099)

11β－羟基类固醇脱氢酶1型(11β－HSD1，基因名字HSD11B1)为糖皮质激素的代谢酶，它催化糖皮质激素C11位的酮基与羟基之间的氧化还原反应，使无活性的17羟11脱氢皮质酮(可的松)转化为有生物活性的皮质醇(人类)，主要作用是调节局部组织糖皮质激素的浓度［1］。在啮齿类，它催化皮质酮与脱氢皮质酮之间的转化［2］。11β－HSD1的表达和活性改变可导致糖皮质激素代谢紊乱，易引发肥胖症、2型糖尿病、高血压等代谢综合征［3－5］。直到最近人们才发现，11β － HSD1基因的表达调控是由选择性启动子控制的［6］，分别是位于远端的启动子1(Promoter 1，P1)和位于近端的启动子2(Promoter 2，P2)。目前关于11β－HSD1选择性启动子的研究不是很多。糖皮质激素是已知HSD11B1的调节子，可以诱导HSD11B1的表达。本文主要是探讨糖皮质激素(GC)诱导HSD11B1表达其选择性启动子的使用情况，为进一步研究GC诱导的HSD11B1表达情况和基因的转录调控模式奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 A549细胞(肺腺癌细胞系)培养在37℃5%二氧化碳90%湿度环境中，用DMEM培养液，添加10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(0.1 mg/mL)和谷氨酰胺(2 mM)，所有培养细胞的产品来自PAA实验室(Coelbe，德国)。

1.2 提取基因组DNA 用机械法收集单层A549细胞，然后加入1 mL细胞裂解液。基因组DNA的提取采用酚/氯仿法:悬浮液中加入1 mL的苯酚旋涡搅拌1 min。将悬浮液在室温下孵育5 min，然后13 000 r/min离心5 min。上相液体被转移到一个新的离心管，加氯仿1 mL旋涡搅拌1 min，混合物再以1 3000 r/min离心1 min(两次)。上相液体被转移到一个新的离心管，加入两个体积的100%乙醇，然后在13 000 r/min离心10 min。片状DNA颗粒用2 mL 70%乙醇洗涤，然后以13 000 r/min离心5 min。最后，DNA颗粒在室温下干燥5 min，溶于500 μL TE缓冲液。

1.3 荧光报告载体的构建 克隆11β－HSD1远端启动子 1(P1，2.173 kb)和近端启动子(P2，2.506 kb)，用A549细胞基因组DNA为模板，引物(见表1)。将PCR产物克隆入pCR2.1－TOPO载体的多克隆位点，通过测序鉴定插入片段。然后将P1和P2片段再次克隆到pGL3荧光报告载体，获得目的荧光报告载体pGL3－P1和pGL3－P2。

1.4 半定量RT－PCR A549细胞用6孔板培养，传代1 d后，待细胞汇合度达90%，加入皮质醇(Cortisol，100 nM)和地塞米松(Dexamethasone，Dex，100 nM)，48 h后，提取细胞总RNA用Master Pure RNA纯化试剂盒。反转录反应用2 μg总RNA，然后根据反转录试剂盒的说明操作。取1 μL反转录产物进行半定量的PCR反应，加入1 U的Phire Hotstart DNA聚合酶，1 mM的dNTP Mix，1倍的Phire反应缓冲液，0.2 μM 的引物(见表1)。PCR反应条件如下:初始变性时间98℃30 s;25个周期循环，98℃变性10 s，退火60℃15 s，延伸72℃15 s;最后一个延伸时间72℃10 min。最后，PCR产物全部用于1%凝胶电泳分离。

表1 实验所用引物

1.5 细胞转染 A549细胞用96孔板培养，传代1 d后，待细胞汇合度达90%，用无抗生素细胞液换液。质粒DNA(pGL3－P1和pGL3－P2，50 ng)分别用 25 μL Opti－ MEM Reduced Serum Medium 稀释待用，细胞转染试剂 LipofectamineTM2000(Invitrogen GmbH，Germany)0.3 μL 用 25 μL Opti－MEM Reduced Serum Medium稀释，混合后室温放置5 min。将已稀释好的质粒DNA与稀释好细胞转染试剂混合后室温放置20 min，然后将50 μL的混合物加入每孔中。将细胞板放入37℃细胞培养箱，4 h后，将稀释好的50 μL含有糖皮质激素Cortisol(100 nM)和 Dexamethasone(Dex，100 nM)的溶液，加入细胞培养孔中，将细胞放入细胞培养箱进行孵育。

1.6 荧光报告基因分析 在细胞转染后48 h，将96孔细胞培养板移出细胞培养箱移去细胞培养液，每孔加入75 μL细胞培养液。然后，每孔加入75 μL Luciferase Reagent(Promega，Germany)，将细胞板上下左右来回轻轻晃动，10 min。然后将细胞裂解物转移到96孔白色微孔板。测量firefly发光用 GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。取出平板每孔加入75 μL Dual－GloTM＆ Glo Reagent(Promega，Germany)，轻轻混合后，放置10 min。Renilla发光测量使用GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。结果分析:Relative luciferase activity(%)= RLUfirefly/RLURenilla(%)，其中RLU代表相对发光单位。

2 结果

2.1 GC诱导HSD11B1 mRNA的表达 糖皮质激素(GC)例如地塞米松(dexamethasone，Dex)和皮质醇(cortisol)都是非常重要的HSD11B1的调节子，可以诱导HSD11B1的表达。为了探讨GC诱导A549细胞中HSD11B1 mRNA的表达其选择性启动子的使用情况，设计特异性引物扩增来自不同启动子的转录产物(见图1)。A549细胞用地塞米松和皮质醇处理48 h后，用半定量－RT－PCR的方法检测GC诱导后HSD11B1 mRNA的表达情况。结果显示HSD11B1 mRNA表达显著增加经由选择性启动子P1和P2，但是P2要强于P1，GC主要通过介导P2诱导HSD11B1 mRNA表达(见图2)。

图1 设计引物检测HSD11B1选择性启动子(P1和P2)的使用情况

2.2 GC诱导荧光报告基因蛋白的表达 从A549细胞基因组中克隆11β－HSD1的两个启动子的基因序列，P1片段长为2.173 kb;P2片段长为2.506 kb(见图3)。将含有P1和P2启动子片段的荧光报告载体pGL3－P1和 pGL3－P2转染到A549细胞。经地塞米松和皮质醇处理后，检测荧光报告载体表达情况，结果显示，GC诱导的P2荧光报告载体相对荧光活性显著增加，然而P1荧光报告载体相对荧光活性没有明显变化(见图4)。

图2 半定量－RT－PCR检测HSD11B1转录产物

图3 HSD11B1选择性启动子P1和P2的PCR产物

图4 GC诱导荧光报告基因的表达

3 讨论

一直以来人们对HSD11B1基因的启动子研究比较少，最近人们研究发现调控HSD11B1基因表达的启动子是由选择性启动子决定的。选择性启动子是指基因上游调控区存在的多个启动子区，每个启动子所启动的表达模式不同，这些启动子的选择性启动在基因表达中起重要的调控作用。研究发现大约有52%的人类编码基因含有2个或者多个选择性启动子，平均每个人类编码基因含有3.1个选择性启动子［7］。最近人们对选择性启动子进行深入研究，发现选择性启动子在选择性剪接基因调控中起到了重要的调控作用［8］。HSD11B1基因表达也是由选择性启动子调控的，研究发现启动子P2在大多数组织和细胞基因转录中占主导地位，包括人类肝脏、皮下脂肪组织和几种常用的细胞系如 Caco－2、C2C12 和3T3 －L1［9］。转录来自于 P1调控的主要出现在人类的肿瘤细胞，如A431和HT－29。此外，C2C12成肌细胞和3T3－L1脂肪细胞分化的过程中，HSD11B1基因转录水平增加主要来自于P2转录增加［9］。本试验应用A549细胞系是人肺腺癌细胞系，通过实验发现选择性启动子P2在肺腺癌细胞中GC诱导HSD11B1表达过程中起主导作用。

此外，本试验结果显示糖皮质激素皮质醇和地塞米松都可以诱导11β－HSD1在转录和翻译水平表达增加，其中皮质醇是11β－HSD1酶氧化还原的产物，地塞米松是皮质醇衍生物，两者匀可导致11β－HSD1酶活性增加。研究发现11β－HSD1酶活性增加，可导致机体代谢紊乱易发生糖尿病、肥胖症、高血压、胰岛素抵抗和骨质疏松等代谢疾病［10－14］。目前，糖皮质激素常用于临床疾病的治疗，糖皮质激素如皮质醇和地塞米松，临床上常用于抗炎、抗过敏、抗病毒和免疫抑制作用的治疗。短期(7 d以内)适量使用GC几乎无副作用，但是长期使用GC副作用明显，会导致物质代谢紊乱，表现为新陈代谢的变动，如血糖升高、食欲增加、体重上升、性欲减退以及极度疲劳等。长期应用糖皮质激素会导致向心性肥胖、糖尿病、高血压等疾病的发生［15－16］。综上所述，无论是糖皮质激素诱导11β－HSD1活性增加还是糖皮质激素本身长期应用对人体都有不利的影响。

本试验通过研究GC诱导HSD11B1基因表达，其选择性启动子的使用情况。结果发现，糖皮质激素诱导HSD11B1表达主要经由选择性启动子P2，该结果为今后研究HSD11B1基因的转录调控模式奠定基础。

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