血浆EBV-DNA在中晚期鼻咽癌诱导化疗前后水平变化

李中文，汤 明，邹 彦

(遵义医学院附属医院肿瘤三病区，贵州遵义 563099)

鼻咽癌好发于我国南方，大量血清流行病学研究已证实EBV与鼻咽癌有关。同时表明血浆EBV－DNA水平和鼻咽的肿瘤负荷、临床分期、预后、肿瘤治疗后复发转移等情况密切相关［1－7］。近年来，随着化放疗手段在鼻咽癌的应用，鼻咽癌的近期生存率有了很大程度的提高［8－9］，但由于鼻咽癌发生部位隐蔽，症状不明显，因此晚期病人居多。对于III、IV期(中晚期)病人的治疗，有大量文献报道，2～4周期诱导化疗+同期放化疗，可以明显提高患者的局部控制率和远期疗效［10－13］。放疗中和同期放化疗前后血浆EBVDNA 水平变化相关研究较多［14－15］，但是缺少诱导化疗前后鼻咽癌患者血浆EBV－DNA水平变化的相关资料。本研究采用荧光定量聚合酶链反应技术分析同一组中晚期鼻咽癌病人诱导化疗前后血浆EBV－DNA水平变化情况。进一步说明诱导化疗在III、IV期鼻咽癌治疗中的价值，并通过血浆EBV－DNA水平变化观察为并诱导化疗与血浆EBV－DNA水平变化关系提供一定参考依据。

1 资料与方法

按照国际抗癌联盟(UICC)第7版分期指南要求，遵义医学院附属肿瘤医院2009年12月至2012年11月收治的Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌患者。

1.1 研究对象纳入标准 ①鼻咽组织活检病理证实为鼻咽非角化型或者角化型鳞状细胞癌;②无严重的内科疾病，血象、肝肾功能基本正常，心电图基本正常;③KPS评分≥70。

1.2 研究对象排除标准 ①年龄80岁以上的患者;②不同意行2周期诱导化疗患者。

1.3 诱导化疗方案 TP方案(紫杉醇135～175 mg/m2d1+DDP80 mg/m2d 2)，4周为1疗程，共计2疗程。

1.4 标本采集 采集血液标本时间为诱导化疗前和2～3程诱导化疗后1～2wk。每位患者收集诱导化疗前后血浆标本至少各1份。

1.5 荧光定量PCR引物及探针的设计 血液标本离心分离血浆，荧光定量PCR［10］。我院实验室德国罗氏公司产定量PCR系统，型号:LightCycle。PCR反应试剂盒是中山医科大学达安基因诊断中心提供。扩增的目的基因来自EBV的BamH1－W相关片段。上下游引物序列分别为W－44F(5'－TCTCTGCCTC－CAGGCAA－3')和W－119R(5'－AGAGGGCCTGTCCACCGT－3')。在 PCR反应体系中加入双标记的荧光探针，探针序列为:5'(FAM)CACTGTCTGTAAAGTCCAGCGTCC(TAMRA)－3'。

1.6 反应体系 抽取外周血2 mL，3 000 rpm，离心 2 min，取血浆 1 000 μL，13 000 rpm，离心 5 min，收集沉淀，纯水洗涤3次。上清液2 μL，8 000 rpm8 s。PCR循环条件:①93℃2 min;②93℃ 45sec→55℃ 60sec→10循环;③93℃ 30sec→55℃ 45sec→30循环。

1.7 血浆游离EBV－DNA含量的计算 血浆中EBV－DNA拷贝数值C=Qx(VDNA/VPCR)×(1/Vext)，其中C为血浆待测DNA拷贝数(copies/mL)，Q为PCR扩增后计算机检测的原始拷贝数值，VPCR是用于PCR扩增的DNA的体积，VDNA为提取的DNA稀释液体积。

1.8 统计学分析 应用SPSS 18.0统计分析软件包进行结果分析，EBV－DNA拷贝数经正态性检验后，治疗前后的比较采用配对秩和检验。

2 结果

①研究对象一般情况:共纳入患者38例，其中男性32例，年龄28～75岁，中位年龄53.6岁，女性6例;年龄31～68岁，中位年龄48.5岁;②III、IV期鼻咽癌患者血浆EBV－DNA定量PCR检测结果本研究纳入的III、IV期鼻咽癌患者EBVDNA检出率为100%(38/38);③诱导化疗前后III、IV期鼻咽癌患者血浆EBV－DNA定量PCR检测结果比较分析诱导化疗后III、IV期鼻咽癌患者血浆EBV－DNA定量PCR检测结果与诱导化疗前相比，阳性率及DNA拷贝数均显著降低(P＜0.05)(见表1)。

表1 鼻咽癌患者诱导化疗前后EBV－DNA拷贝数比较(×103copies/mL)

3 讨论

鼻咽癌以亚洲人居多，中国人更是占全世界鼻咽癌的高发区。自OLD发现EBV(Epstein－Barr virus，EBV)与鼻咽癌在血清上有一定的关系以来。而鼻咽癌中非角化型或者角化型鳞状细胞癌又占90%以上。EBV和鼻咽癌的关系密切，基本上所有的非角化型或者角化型鳞状细胞癌都能检测到EBV－DNA。近年来由于检测手段的提高，血浆EBV－DNA对于鼻咽癌的敏感性和特异性均较高。荧光定量PCR技术不仅具有PCR的高灵敏度，同时还具有准确、快速、不容易被污染的特点。同时为研究血浆EBV－DNA水平提供了可靠、安全、稳定的方法。相关文献资料表明血浆EBVDNA水平相对恒定，敏感性和特异性均较高。本组的EBV－DNA敏感性为100%。并且大量文献证实EBV－DNA水平和鼻咽的肿瘤负荷，临床分期，预后，肿瘤治疗后复发转移情况密切相关［1－7］。EBV－DNA复制量随着肿瘤负荷的增加，病情的加重而逐渐增加。诱导化疗后患者的肿瘤负荷有所减小，患者的分期降低，使得没有放疗指针的患者经过化疗后转移灶消失可以放疗，为进一步放疗提高疗效，增加局部控制率和重要器官的保护有着重要的作用。因此诱导化疗在III、IV期鼻咽癌的治疗中起着重要的作用，并且广泛应用于III、IV期鼻咽癌的治疗。观察诱导化疗前后患者EBV－DNA是否有变化，期待进一步证实随着肿瘤负荷的减少，EBV－DNA复制量在下降，为以后诱导化疗方案的选择提供参考。为化疗方案的选择提供更多的观察指标。

我们应用荧光定量PCR技术对38例(III、IV期)鼻咽癌初治患者在诱导化疗前后EBV－DNA水平进行定量检测。表明诱导化疗前III、IV期和合计EBV－DNA拷贝数中位数和范围均高于诱导化疗后，与治疗前相比，各分期中和总的血浆EBV－DNA水平均显著降低。

以上结果证实患者EBV－DNA水平在诱导化疗后下降，甚至检测不出来。这和放疗后患者EBV－DNA基本消失相符合。从EBV－DNA水平的角度印证了诱导化疗在鼻咽癌治疗中的价值和地位。值得提出的是EBV－DNA在诱导化疗后消失的患者，以后是否会再次出现阳性，有待于进一步研究。

综上所述，诱导化疗后患者的血浆EBV－DNA水平在下降，甚至消失。对于不同方案诱导化疗后EBV－DNA水平变化，和是否通过观察EBV－DNA水平变化来选择化疗方案，有待进一步证实。

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