小黄蘑提取物对亚硝化反应的抑制作用

张海民,张令文,,计红芳,杨铭铎,王丹丹,郭霞,杨雪美

（1.河南科技学院,河南新乡453003；2.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150076）

小黄蘑提取物对亚硝化反应的抑制作用

张海民1,张令文1,2,计红芳1,杨铭铎2,王丹丹1,郭霞1,杨雪美1

（1.河南科技学院,河南新乡453003；2.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150076）

以小黄蘑为原料,经过体积分数为50%的无水乙醇提取,获得了石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水4种不同极性的提取物,并对这4种提取物的抑制亚硝化作用进行了研究.结果表明：4种提取物对亚硝胺均有阻断作用,随着小黄蘑提取物浓度的增加,其对亚硝胺的阻断作用逐渐增强.在低质量浓度范围内（0.5～4.0 g/L）,石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物对亚硝胺的阻断作用均高于阳性对照Vc的阻断作用,石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物对亚硝酸盐的清除作用均高于同浓度的阳性对照Vc的清除效果；当质量浓度达到16 g/L时,石油醚、乙酸乙酯、甲醇提取物的清除作用更强.提取物化学成分测定结果表明,乙酸乙酯和甲醇提取物抑制亚硝化作用的主要成分为皂苷和黄酮类物质.

小黄蘑；提取物；亚硝化；抑制作用

N-亚硝基化合物是目前所知的最强的化学致癌物之一,能引起人和动物的胃、肝脏等多种器官的恶性肿瘤.亚硝酸盐是N-亚硝基化合物的合成前体,尤其在人和动物的胃内,特别适于N-亚硝基化合物的合成[1].因此,清除亚硝酸盐是当今研究预防癌症的重要课题[2].一般采取阻断亚硝胺合成、清除亚硝胺前体或利用烷基自由基等措施,以达到抑制亚硝化、预防癌症的目的.目前研究表明,许多植物对亚硝胺的合成均有一定的抑制作用,如荸荠皮、橘皮、油菜蜂花粉、山楂、洋葱、玫瑰等[2-9].

小黄蘑,学名柠檬蜡伞Hygrophorus lucorum Kalchbr,是外生菌根真菌,属伞菌目Agaricales、蜡伞科Hygrophoraerae.小黄蘑生长在东北落叶松等针叶林地上,通常在秋季出现,数个群生,新鲜时肉质无臭无味,干后碎质.小黄蘑富含蛋白质、氨基酸、糖类、Vc及钙、镁、锰、锌、钾等矿物质,其食用价值和营养价值极高.可降胆固醇、抗癌,促进新陈代谢,提高机体免疫力,还能消食去热,滋阴补阳,增加乳汁,促进创伤愈合,护肝健胃.目前,对小黄蘑的相关研究鲜见报道[10].开展小黄蘑提取物抑制亚硝化的作用研究,旨在为小黄蘑的开发应用提供科学的理论依据,对从植物原料中提取天然抗癌剂的研究开发具有一定的指导作用.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：小黄蘑,购自阿尔山地区.生化试剂：芦丁、人参皂苷Rg1对照品购于上海同田生物技术有限公司,其他试剂均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备

FA2004型电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）；FW-400A型倾斜万能高速粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；SHA-C水浴恒温振荡器（江苏金坛市中大仪器厂）；RE52-98旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；WFJ7200可见光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）.

1.3 试验方法

1.3.1 小黄蘑提取物的制备取3 g烘干粉碎的小黄蘑放入锥形瓶中,加入60mL体积分数为50%的乙醇溶液,于35℃水浴振荡12 h,按相同方法提取3次,合并3次滤液,减压浓缩得小黄蘑提取物.

称取以上提取物2 g,溶解于蒸馏水中,得到混浊悬浮液,摇匀,转入分液漏斗中,分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇进行萃取,每次4 h,共萃取3次.浓缩后即可得石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水萃取物.

1.3.2 小黄蘑提取物抑制亚硝化反应

对亚硝胺合成的阻断作用：分别移取不同浓度小黄蘑提取物水溶液1mL于10mL容量瓶中,加入pH 3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液5mL,1mmol/L的NaNO2溶液0.5mL,1mmol/L二甲胺溶液0.5mL,再用蒸馏水定容至刻度,在37℃下恒温1 h.用移液管吸取1.0mL上述含NDMA的反应液置于称量皿中,加入质量分数为0.5%的Na2CO3溶液0.5mL,于黑布遮盖的紫外分析仪上照射15min,紫外灯离液面15 cm,取出后加1.5mL质量分数为1%的对氨基苯磺酸溶液,再加1.5mL质量分数为0.1%的α-萘胺,0.5mL蒸馏水,然后摇匀静置15min后,用分光光度计在525 nm处测吸光度A,同时用浸提剂做空白试验,并按下述公式计算阻断率：

式中：A0为加入对应浓度浸提剂的空白样的吸光度值,Ax为加入各组提取液时的吸光度值.

对亚硝酸钠的清除作用：分别移取不同浓度小黄蘑提取物水溶液1mL于10mL容量瓶中,加入pH 3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液5mL,再加入质量分数为0.01%的NaNO2溶液1mL,用蒸馏水定容至刻度, 37℃下恒温1 h,然后各吸取1.0mL反应液于锥形瓶中,加入质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸溶液2mL,质量分数为0.2%的N-1-萘乙二胺盐酸盐溶液2mL,摇匀放置15min后,用分光光度计在540 nm处测吸光度A,分别用相应浓度相同用量的浸提剂做空白试验,最后按下式计算清除率：

清除率/%=（A0-Ax）/A0×100.

式中：A0为加入相应浸提剂空白实验的吸光度值,Ax为加入不同浓度浸提剂时的吸光度值.

1.3.3 小黄蘑提取物总黄酮含量的测定方法

标准曲线的绘制：采用Nieva等的方法并稍作修改[11].精密称取芦丁对照品5.0mg,置于50mL容量瓶中,加体积分数为80%的乙醇适量,使充分溶解,放冷,用体积分数为80%的乙醇稀释至刻度,摇匀,即得0.1 g/L对照品溶液.

精确量取对照品溶液0.12、0.24、0.48、0.72、0.96mL置25mL容量瓶中,分别加入体积分数为30%的乙醇补至12.5mL,然后加入1.0mL质量分数为5%的硝酸铝溶液,5min后加入1.0mL质量分数为10%的乙酸钾溶液,6min后加入10mL质量分数为4%的氢氧化钠溶液,混匀后加入体积分数为30%的乙醇至125mL.10min后,于500 nm处测吸光度.用最小二乘法绘制标准曲线,得芦丁含量y/mg与吸光度A之间的回归方程.

小黄蘑提取物总黄酮的含量测定：取10mg小黄蘑不同提取物,用体积分数为80%的乙醇定容至100mL,即得0.1mg/mL的样品溶液.取定容后的样品溶液0.15mL于25mL具塞试管中,其余步骤与标准曲线制作方法相同.小黄蘑提取物总黄酮含量的计算公式为：

总黄酮含量/%=（样品溶液中的黄酮总量/对应小黄蘑提取物的量）×100

1.3.4 小黄蘑提取物总皂苷含量的测定方法

标准曲线绘制：采用陈勋等[12]的方法并稍作修改.准确称取干燥至恒重的人参皂甙Rg1对照品4.5mg,加体积分数为60%的乙醇溶解并定容至10mL摇匀,作为对照品溶液.

分别准确吸取对照品溶液0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于具塞试管中,放入60℃水浴中挥干溶剂.然后加入新配制的体积分数为5%的香草醛－冰乙酸溶液0.20mL,高氯酸0.80mL,摇匀在60℃水浴中加热15min,流水冷却,加冰醋酸5mL,摇匀,放置20min,在波长548 nm处测定吸光度,体积分数为60%的乙醇溶液随行空白对照.以皂苷浓度为纵坐标,吸光度为横坐标,绘制标准曲线.

小黄蘑提取物总皂苷的含量测定：分别取10mg小黄蘑提取物,用体积分数为80%的乙醇定容至100mL,即得0.1 g/L的样品溶液.分别取定容后的样品溶液0.15mL于25mL具塞试管中,其余步骤与标准曲线制作方法相同.小黄蘑提取物总皂苷含量的计算公式为：总皂苷含量/%=（样品溶液中的皂苷总量/对应小黄蘑提取物的量）×100

2 结果与分析

2.1 小黄蘑提取物对亚硝化反应的抑制作用

2.1.1 对亚硝胺的阻断作用不同质量浓度的小黄蘑提取物对亚硝胺的阻断作用见表1.

表1 不同质量浓度的小黄蘑提取物对亚硝胺的阻断作用Tab.1 Inhibiting effectsof Hygrophorus lucorum extractson nitrosation

由表1可知,随着石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水提取物质量浓度的逐渐增大,其对亚硝胺的阻断作用也逐渐增强,该变化趋势与阳性对照Vc的阻断作用相类似.在低质量浓度范围内（0.5～4.0 g/L）,小黄蘑石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物对亚硝胺的阻断作用均高于阳性对照Vc的阻断作用；在高质量浓度范围内（8.0～16.0 g/L）,阻断作用更强.结果表明,4种提取物对亚硝胺均有一定的阻断作用,其阻断活性强弱稍有差别,石油醚,乙酸乙酯,甲醇均比水的阻断作用更强.

2.1.2 对亚硝酸钠的清除作用不同质量浓度的小黄蘑提取物对亚硝酸钠的清除作用见表2.

表2 不同质量浓度的小黄蘑提取物对亚硝酸钠的清除作用Tab.2 Scavengingability of Hygrophorus lucorum extractson sodium nitrite

由表2可知,4种小黄蘑提取物对亚硝酸钠均有一定的清除作用.随着小黄蘑4种提取物质量浓度的增加,对亚硝酸钠的清除作用逐渐增强.当试验体系中加入的小黄蘑提取物质量浓度达到16 g/L时,清除率可达最大,范围在29.99%～40.03%之间；石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物对亚硝酸钠的清除作用均比水强,且均高于同浓度的阳性对照Vc的清除效果.

2.2 小黄蘑提取物总黄酮含量测定2.2.1标准曲线的绘制在500 nm下分别测定不同含量芦丁的吸光度值.芦丁含量分别为120、240、480、720、960μg时,测得的吸光度值分别为0.152、0.290、0.584、0.837和1.180.拟合得回归方程：y=0.001 2x+0.000 4（R2= 0.997 7）,标准曲线见图1. 2.2.2小黄蘑提取物的总黄酮含量小黄蘑不同提取物中总黄酮的含量见图2.

由图2可知,不同极性溶剂提取的总黄酮含量高低顺序为：乙酸乙酯提取物（10.33%）＞甲醇提取物（8.63%）＞石油醚提取物（7.91%）＞水提取物（3.31%）.

2.3 小黄蘑提取物总皂苷含量测定

2.3.1 标准曲线的绘制在548 nm下分别测定不同含量Rg1的吸光度值.Rg1含量分别为25、50、100、200、300、400、500μg时,测得的吸光度值分别为0.066、0.152、0.313、0.694、1.005、1.388和1.713.据此拟合得回归方程：y=0.003 5x-0.023（R2=0.999 5）,标准曲线见图3.

2.3.2 小黄蘑提取物的总皂苷含量小黄蘑不同提取物中总皂苷的含量见图4.

由图4可知,不同极性溶剂提取的总皂苷含量高低顺序为：甲醇提取物（7.45%）＞乙酸乙酯提取物（6.25%）＞石油醚提取物（4.4%）＞水提取物（1.9%）.

图1 总黄酮含量测定标准曲线Fig.1 Standard curveof total flavonidscontents

图2 小黄蘑不同提取物中总黄酮的含量Fig.2 Contentof total flavonidsof Hygrophorus lucorum extracts

图3 总皂苷含量测定标准曲线Fig.3 Standard curveof totalsaponins contents

3 结论

以小黄蘑为原料,经过体积分数为50%的乙醇溶液提取,获得了石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水4种不同极性溶剂的提取物,并对其抑制亚硝化的作用进行了研究.结果表明,这4种提取物均有一定的抑制亚硝化反应的能力,质量浓度越高,活性越强.

在低质量浓度范围内（0.5～4.0 g/L）,石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物对亚硝胺的阻断作用均高于阳性对照Vc的阻断作用.当试验体系中加入的小黄蘑提取物质量浓度达到16 g/L时,其清除率均可达最大值；石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物对亚硝酸钠的清除效果在29.99%～40.03%之间,比水提取物的活性强,且均高于同浓度的阳性对照Vc的清除效果.

提取物化学成分含量测定结果表明,乙酸乙酯提取物和甲醇提取物抑制亚硝化作用的主要成分为皂苷类和黄酮类物质.

图4 小黄蘑不同提取物中总皂苷的含量Fig.4 Totalsaponinscontentsof Hygrophorus lucorum extracts

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（责任编辑：邓天福）

Inhibition on nitrosation of Hygrophorus lucorum Kalchbr extracts

ZhangHaimin1,Zhang Lingwen1,2,JiHongfang1,Yang Mingduo2,Wang Dandan1,Guo Xia1,Yang Xuemei1
（1.Henan InstituteofScienceand Technology,Xinxiang453003,China；2.Instituteof Food Engineering,Harbin University ofCommerce,Harbin 150076China）

With small yellowmushroom extractas raw material,petroleum ether extract,ethyl acetate extract,methanol extract and water extract was obtained through different polarity solvent extraction from 50%ethanol extracts．Inhibiting effects of nitrosation of four kinds of solvent extract were studied．The results showed that in the range of low concentration（0．5～4．0 g/L）,nitrosamines blocking effects of petroleum ether extract,ethyl acetate extract and methanol extract of small yellow mushroom was higher than the positive effect of vitamin C．In the test range,with the increase of concentration of petroleum ether,ethyl acetate and methanol extract from small yellow mushroom, scavenging of sodium nitrite was gradually strengthened,when extract concentration reached to 16 g/L,the removal rate reach the maximum value．Extract chemical composition content determination results showed that the main component of ethyl acetate extract and methanol extract inhibited the nitrification were saponins and flavonoids substances．

Hygrophorus lucorum Kalchbr；extracts；nitrosation；inhibition ability

TQ461

A

1008-7516（2013）03-0042-05

10．3969/j．issn．1008-7516．2013．03．008

2013-05-01

国家人事部留学人员科技活动择优资助项目（200306AD）；河南科技学院高层次人才科研启动项目（2007041）

张海民（1983-）,男,山东菏泽人,硕士,助教．主要从事体育营养与保健研究．

计红芳（1978-）,女,黑龙江安达人,博士,副教授．主要从事天然活性产物、食品营养与安全方面的研究．