白色念珠菌缺失株△ptc2/△pph3的表型试验

李微微 （黑龙江省七台河市畜牧兽医局 154699）

白色念珠菌缺失株△ptc2/△pph3的表型试验

李微微 （黑龙江省七台河市畜牧兽医局 154699）

本试验利用野生型白色念珠菌RM1000菌株为对照，对实验室提供的 △ ptc2/△ pph3双基因缺失株的表型进行了初步研究。结果显示，与野生型相比， △p tc2/△p ph3双基因缺失株生长缓慢，对数生长期延迟，对SDS敏感。试验结果为深入研究PTC2和PPH3基因的功能奠定了基础。

白念珠菌 PTC2 PPH3 表型

白色念珠菌(Candida albicans)，又名白假丝酵母，是一种重要的条件性致病真菌，细胞能够以孢子(sporus)、假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)三种形态存在。随着皮质类激素、免疫抑制剂和抗生素的广泛应用，白色念珠菌耐药菌株增加，发病率呈上升趋势，白色念珠菌感染已经成为国内外医学界关注的重要课题[1]。PTC2是白念珠菌中重要的2C类蛋白磷酸酶，能通过将底物蛋白可逆磷酸化，调节底物活性，蛋白质的可逆磷酸化是真核细胞的一个关键调控机制，增加细胞的抗逆性。PPH3与白念珠菌DNA检验点密切相关。ptc2和pph3双基因缺失后可能对细胞周期和菌丝生长发育产生影响[2]。本试验对△ptc2/△pph3缺失株进行了相关表型分析，为后续研究PTC2和PPH3基因的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株复苏与活化 取RM1000与△ptc2/△pph3菌种，利用划线法分别转接到两个固体YPD(2%蛋白胨，2%葡萄糖，1%酵母提取物，2%琼脂粉)平板上，标记后放在30℃恒温培养箱内过夜培养。

1.2 菌株细胞生长曲线的测定 按照1∶100体积比，将过夜培养的YPD菌液转接到250ml YPD液体培养基中，放入30℃的摇床内培养，从转接开始，每隔2h测定2个三角瓶内液体在600nm的OD值，记录数值并作曲线。

1.3 SDS平板表型试验 取已制备的0.015%SDS＋YPD平板和YPD平板，分别接种稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的RM1000与△ptc2/△pph3菌液。接种采用点接，每个点取3μl液体，且相邻点要隔一定距离，等液体被完全吸收翻过平板倒扣，并做好标记，放入30℃恒温培养箱内培养。

1.4 菌丝生成试验 取出已倒好的10%FBS＋YPD平板和YPD平板，取100μl无菌水滴在平板上，然后分别取稀释10-5倍的RM1000菌液和△ptc2/△pph3菌液3ul滴在无菌水滴上，用三角玻璃棒均匀涂抹，盖上盖倒扣，做好标记。平板涂好后放入30℃恒温培养箱内培养。

2 结果

2.1 △ptc2/△pph3菌株生长期延迟 为了考察△ptc2/ △pph3缺失株的生长情况，我们以野生型菌株RM1000为对照，对△ptc2/△pph3进行了生长曲线的测定。试验结果显示，与野生型菌株相比，双基因缺失株对数生长期延迟，说明PTC2和PPH3双基因缺失后，白念珠菌细胞周期延迟，PTC2对于PPH3的去磷酸化在细胞周期中有着重要的作用。

图1 △ptc2/△pph3菌株和野生型菌株生长曲线

2.2 缺失株对于SDS的敏感性 为了检验缺失株的细胞膜完整性，我们选用了0.01%的SDS进行测试。结果发现，与野生型相比，PTC2和PPH3双基因缺失后，影响了细胞膜完整性，从而表现出对SDS敏感。

图2 △ptc2/△pph3菌株和野生型菌株在0.01%SDS+YPD培养基中的生长情况

2.3 缺失株的菌丝形成 为了检验缺失株菌丝形成方面的情况，选用10%FBS+YPD固体培养基进行测试。结果显示，RM1000形成乳白色较大卵圆形菌落，表面较干燥，边缘规则，透明度低，有菌丝状。ptc2/ △pph3乳白色较大圆形菌落，表面湿润，边缘规则，稍有透明度，无菌丝状。说明ptc2/pph3这两个基因对于白念的菌丝发育形成过程中有着重要的作用。

图3 △ptc2/△pph3菌株和野生型菌株菌丝生长情况对比

3 讨论

白念珠菌中细胞检验点相关信号转导通路的蛋白磷酸化在细胞生长发育和菌丝形成中有着重要的作用[3]。研究细胞检验点相关蛋白的磷酸化和去磷酸化，可以筛选出抗真菌药物的靶点。PTC2蛋白是重要的2C类蛋白磷酸酶，可能在与细胞周期检验点相关信号通路中关键的蛋白质去磷酸化过程中发挥着重要的作用，而PPh3蛋白是细胞周期检验点中重要的因子[4, 5]。因此，为进一步考察PPH3的生物学功能和明确调节PPH3磷酸化状态的重要调控蛋白，能够为深入了解PTC2基因和PPH3基因的生物学功能提供重要的实验支持。鉴于前人已经对PTC2和PPH3单基因缺失株的表型进行了充分研究[6, 7]，但对于PTC2和PPH3双基因缺失株缺乏详细的表型试验考察，故本研究针对△PTC2/△PPH3双基因缺失株的表型试验进行了数据补充，为后续深入研究PTC2和PPH3基因的功能奠定了基础。

[1] 黄睿, 辛建保. 肺部白色念珠菌与非白色念珠菌感染危险因素的比较[J]. 临床内科杂志, 2009, 26(5).340.

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[3] 任南, 文细毛. 白色念珠菌致病机制的研究进展[J]. 中国感染控制杂志, 2003(4).

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