QuEChERS-联免疫吸附法检测动物源性产品中阿维菌素残留

周洪娟 崔言顺 （山东农业大学 泰安 271018）

魏可鹏 张立东 （临沂出入境检验检验局）

QuEChERS-联免疫吸附法检测动物源性产品中阿维菌素残留

周洪娟 崔言顺 （山东农业大学 泰安 271018）

魏可鹏 张立东 （临沂出入境检验检验局）

本研究采用QuEChERS净化法，样品用乙腈提取，ODS吸附剂粉分散固相萃取净化，检测动物源性食品中的阿维菌素。该方法的最低检测限1.0μg/kg，回收率在68.3%～85.6%之间。通过3种不同种类动物源性产品中阿维菌素残留量的检测表明，该方法稳定、可靠，能满足动物源性食品中阿维菌素类药物残留检测需要。

QuEChERS ELISA 阿维菌素类药物残留 检测

阿维菌素类药物是现在兽医临床应用最广泛的广谱、高效的大环内脂类抗寄生虫药物。特别是对家畜的胃肠道线虫、体外寄生虫有特殊疗效。但作为脂溶性化合物，在动物体内残留时间长，按世界卫生(WHO)的5级分级标准，阿维菌素药物属于高毒化合物。美国、欧盟、日本等国家纷纷制定了阿维菌素类药物的最高残留限量，2002年12月我国农业部也对阿维菌素的最高残留限量有了新的标准，并将检测农兽药中阿维菌素类药物的残留量列为监控的重点。

阿维菌素药物目前的主要检测方法有：酶联免疫吸附试验、液相色谱法、液相色谱-串联质谱等仪器方法。而与仪器方法相比，酶联免疫法具有检测成本低，操作简单，灵敏度高，可进行大批量检测等优点。致使国外发达国家将免疫分析技术，色谱分析技术共同列为兽药残留的分析技术。肉制品组织中阿维菌素类药物的净化方法主要有液液萃取、固相柱萃取(SPE)、分散固相萃取法(QuEChERS)以及超临界流体萃取等方法。QuEChERS方法是2003年由美国化学家Steven J.Lehotay和德国化学家Michelangelo Anastassiadas提出的一种快速、简单、低成本的样品处理方法，该方法的关键是采用分散固相萃取净化法，即提取直接加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂粉末进行净化，经离心后用于仪器的检测。该方法回收率高，精确度高，溶剂适用量少，污染少，操作简单，且样品制备过程简单，成本较低。在农兽药残留分析中使用也越来越广泛。

1 材料与方法

1.1 仪器 MK3酶标仪、旋转蒸发仪、均质器(IKA T25)、震荡器(IKA MSI)、高速冷冻离心机、天平：感量0.001g、2ml一次性注射器微量移液器，0.45μm针头过滤膜，5～50μl、20～200μl、多道50～300μl。

1.2 试剂与材料 乙腈(分析纯)、无水硫酸镁(分析纯)、ODS吸附剂购自Agela Technologlogies INC；阿维菌素酶联免疫试剂盒；北京望尔生物技术有限公司提供。试验样品购自超市。

1.3 组织样品前处理方法 称取3±0.003g样品，加入9ml乙腈，振荡提取20min，110000g以上离心10min，取上清液4ml。置40℃下旋转蒸发至干，加入1ml稀释了的复溶液和100mgODS吸附剂粉，1400r/m涡旋混匀2min，4500g 15min 5℃离心。取上清液过0.45μm针头过滤膜，收集滤液，取20μl进行ELISA试验分析。

1.4 酶联免疫试剂盒的检测步骤 （1）将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20～24℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2～8℃不要冷冻。（2）编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。用加样器每孔加标准品或样本20L后，每孔再加80L抗体溶液。用盖板膜盖板后置于37℃环境反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液每孔250L充分洗涤4～5次，每次间隔10～20s，用吸水纸拍干。（3）加酶标记物：每孔加入100L。用盖板膜盖板后置37℃环境反应30min，取出重复洗板步骤。显色：每孔加入底物液A液50L，再加底物液B液50L，轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。（4）测定：每孔加入终止液50L，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定每孔OD值。

1.5 结果判定 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%，即百分吸光度值。

附图 阿维菌素标准曲线

2 结果

2.1 方法的验证 按QuEChERS方法净化后，对空白样品加标方法进行回收率试验，分别对猪肉、牛肉、鸡肉进行了3个水平的加标，每个水平平行测定6次，提取后 ，计算样品的加标回收。用回收率来表示检测方法的准确度，结果见附表。

根据此表可以看出，用QuEChERS前处理，在猪肉组织样品中阿维菌素的添加回收率在65.4%～92.7%之间，在牛肉组织样品中阿维菌素的添加回收率在70.2%～94.1%之间，在鸡肉组织样品中阿维菌素的添加回收率在74.6%～92.5%之间。所有样品的平均回收率在65.4%～94.1%之间。变异系数在2.38%～11.01%。

附表 阿维菌素回收率试验 (μg/kg、%)

3 讨论

阿维菌素类药物微溶于正己烷，影响其回收率，因此选用乙腈代替正己烷；用QuEChERS前处理的分散固相萃取技术中的ODS粉对目标物的吸附少，优于C18粉，同时可以很好地吸附脂肪酸，色素等杂质；其次与碱性氧化铝柱相比，操作简便，节省时间，不同于阿维菌素试剂盒中高脂肪组织的前处理。

4 结语

本文将QuEChERS技术引入到阿维菌素兽药残留分析的样品前处理过程，代替原有的ELISA方法中碱性氧化铝柱的过柱，溶剂适用量少，污染少，使之操作步骤简化，检测时间缩短，实用性更强。本试剂盒的最低检测限(碱性氧化铝柱过柱)为1.0μg/kg，运用QuEChERS方法，在最低检测限附近添加回收率在68.3%～85.6%之间，符合检测要求。该方法回收率高，精确度高，溶剂适用量少，污染少，操作简单，且样品制备过程简单，成本较低。为进一步大批量处理筛选检测样品提供参考。

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