禽源空肠弯曲杆菌的分离与双重PCR鉴定

翟海华 （山东农业大学动物科技学院 泰安 271000）

王 娟 常维山 王君玮 （中国动物卫生与流行病学中心 青岛）

试验研究

禽源空肠弯曲杆菌的分离与双重PCR鉴定

翟海华 （山东农业大学动物科技学院 泰安 271000）

王 娟 常维山 王君玮 （中国动物卫生与流行病学中心 青岛）

以空肠弯曲杆菌保守基因mapA和hipO基因为靶基因，建立空肠弯曲菌的双重PCR方法，该方法只对空肠弯曲菌有特异性，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等则不能扩增出特异性片段。利用该方法对从市场、养殖鸡和屠宰场的禽源空肠弯曲菌进行了分离和鉴定，平均分离率为35.8%,PCR鉴定结果与生化鉴定结果相一致，说明建立的双重PCR鉴定方法具有灵敏、特异的特点，可节省传统生化鉴定所耗费的时间，为空肠弯曲菌的检测提供新方法。

空肠弯曲菌 分离 双重PCR

食源性致病菌作为一个公共卫生问题是影响食品卫生安全的主要因素之一，而空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)就是食品卫生中一种非常重要的食源性致病菌。它是引起人类细菌性腹泻的最重要原因之一，在很多动物特别是禽类体内属于正常携带细菌，如果屠宰过程中不注意卫生操作，或者加工不完全，便能够通过食物链传递给人类。可以引起人类发热、急性胃肠炎，儿童易发病，免疫低下者会进一步导致心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎、败血症等全身性疾病，最严重的并发症是某些血清型的C.jejuni感染会引起周围神经自身免疫性疾病-格林巴利综合症(Guillain Barre syndrome, GBS)。空肠弯曲杆菌属于弯曲杆菌属，是革兰氏染色阴性菌；具有多形性，呈弧形、螺旋形、海鸥展翅形或S形；无芽胞；一段或两端有一根鞭毛，呈螺旋性滚动，陈旧培养基中菌形变球状，丧失动力；为微需氧菌，在大气或厌氧的环境中菌不生长。是人畜共患的致病菌，在畜牧业上，空肠弯曲杆菌可以引起牛和绵羊流产，火鸡的肝炎和蓝冠病，童子鸡和雏鸡坏死性肝炎，雏鸡、犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病。

随着分子生物学技术的发展，PCR方法已经广泛应用于各种病原微生物的检测，本研究利用空肠弯曲杆菌的特异性的外膜蛋白A基因(mapA)和马尿酸基因(hipO)对从市场和屠宰场分离到的空肠弯曲菌进行双重PCR鉴定，不仅方便快捷，节省了生化试验的时间和成本，而且特异性强，可信度高。

1 材料和方法

1.1 培养基 Cary-Blair氏运送培养基(北京路桥)，空肠弯曲杆菌选择性琼脂基础以及配套试剂(sigma公司)，哥伦比亚血琼脂基础(OXOID公司)。

1.2 主要试剂及器材 新鲜绵羊血(青岛海博生物科技公司)，2×Taq PCR Master Mix(Promega公司)，DNA marker DL2000(TaKaRa宝生物(大连)有限公司)，厌氧培养盒和微需氧产气袋(日本三菱公司)。

1.3 样品来源 青岛市市场上出售活鸡的泄殖腔棉拭子，中国动物卫生与流行病学中心门诊实验室养殖鸡的泄殖腔棉拭子，青岛市某禽屠宰场鸡盲肠。

1.4 试验菌株 空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC 33560，大肠埃希菌ATCC 25922，金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213，阪崎肠杆菌标准菌株ATCC 51329，鼠伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC（B）50115由中国动物卫生与流行病学中心实验室提供。

2 方法

2.1 培养基制备 Cary-Blair氏运送培养基：称取12.7g培养基溶于l000ml水中，121℃高压蒸气灭菌15min，冷却至适当温度，无菌分装至5ml离心管中，4℃保存。空肠弯曲杆菌选择培养基：40g培养基溶于lO00ml水中，121℃高压蒸气灭菌15min，冷却到50℃左右时加入5%新鲜绵羊血和空肠弯曲菌琼脂补剂III(Skirrow)，空肠弯曲菌琼脂补剂III(Skirrow)事先用2ml蒸馏水溶解，无菌倒平皿，4℃保存备用。哥伦比亚血平板：39g培养基溶于lO00ml水中，121℃高压蒸气灭菌15min，冷却到50℃左右时加入5%新鲜绵羊血，无菌倒平皿，4℃保存备用。

2.2 细菌的分离培养 将无菌采集的泄殖腔棉拭子置于灭菌Cary-Blair氏运送培养基中，低温运回实验室，划线接种于空肠弯曲杆菌选择培养基上。采集的盲肠样包装好，同样低温运回实验室，用接种环勾取少量盲肠内容物，划线接种于空肠弯曲杆菌选择培养基上。划好的培养基放入厌氧培养盒内，加上微需氧产气袋，42℃培养36～48h。选择可疑菌进行染色镜检，并接种于哥伦比亚血平板进行纯化，纯化培养2～3代后可以进行甘油保存或血清保存。

2.3 PCR鉴定 （1）引物设计：根据GenBank上发表的空肠弯曲杆菌特异性基因mapA，hipO的序列设计了两对引物，分别是mapA上游：CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG，mapA下游：GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A，扩增片段长度为589bp；hipO上游：ACT GCA AAA TTA GTG GCG，hipO下游GAG CTT TAG CAA ACC TTC C，扩增片段长度为1028bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。（2）模版DNA提取：用接种环挑取哥伦比亚培养基上的适量菌落于500μL灭菌的超纯水中，涡旋混匀，12000rpm/min，离心5min，移去上清；再加入200μL灭菌水，吹打混匀，放入100℃水浴锅内作用10min；取出立即冰浴5～10min，12000rpm/min，离心5～10min，取上清于新的1.5ml离心管中。（3）PCR扩增：PCR反应体系(25μL):2×Taq PCR Master Mix12.5μL，DNA模板1.5μL，引物各0.5μL，双蒸水9μL。循环参数为：94℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环后72℃延伸10min。将PCR产物于1.2%琼脂糖(0.5×TBE)凝胶电泳后，观察并成像。（4）特异性试验：提取空肠弯曲杆菌标准菌株ATCC33560与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌标准菌株6种细菌DNA，进行双重PCR方法的特异性考察。

2 结果

2.1 细菌分离培养 在空肠弯曲杆菌选择性培养基上可疑菌落呈灰色或棕黄色或浅红色、圆形，半透明，扁平湿润有光泽，有呈沿接种线向外扩散的趋势。染色镜检为螺旋形、弯曲杆状或似飞翔的海鸥形的革兰氏阴性细菌。

2.2 双重PCR方法的特异性 电泳结果表明，该两对引物仅能对空肠弯曲杆菌扩增出两个特异片段，大小分别约为1028bp和589bp，与设计DNA片段大小相符。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌均未有扩增产物(附图)。表明该方法具有很好的特异性。

2.3 双重PCR方法的应用 利用上述细菌分离方法和双重PCR方法，对从市售活鸡上采集的20份泄殖腔棉拭子，中心养殖鸡的30份泄殖腔棉拭子，青岛某屠宰场100份盲肠样进行空肠弯曲杆菌的分离鉴定，其中市售活鸡样品分离到8株空肠弯曲杆菌，分离率为40%，养殖鸡样分离得到13份菌株，分离率为43.3%，屠宰场盲肠样分离到24株，分离率为24%。

附图 双重PCR引物特异性验证结果

3 讨论

（1）空肠弯曲杆菌常用的选择性分离培养基主要有两大类：一类是含血液的培养基，像Campy-BAP琼脂、Skirrow琼脂和Butzler氏琼脂等；另一类是不含血液的培养基如CCDA、卵黄琼脂等。这些培养基中的血液、碳粉和铁盐可以吸附氧气和毒性物质，从而保证空肠弯曲菌具有良好的生长状态。我们使用的空肠弯曲杆菌选择培养基属于Skirrow琼脂，典型菌落灰色或棕黄色或浅红色、圆形，半透明，扁平湿润有光泽，比较容易分辨。（2）空肠弯曲杆菌是微需氧菌，微需氧产气袋可以吸收容器中1/2的O2，使CO2浓度变为7%～8%，从而制造出微需氧的环境。使用产气袋，产生的气体环境稳定，方便快捷，但是成本较高。也可以在密闭容器内充入混合气体，具体比例为N285%，CO210%，O25%。使用混合气体成本低，就是操作较复杂，可以在初次分离培养时用微需氧产气袋，纯化培养时用混合气体。（3）空肠弯曲杆菌的准确鉴定可以为它的流行病学及和危害评估提供重要依据，由于空肠弯曲杆菌培养条件比较苛刻，需要微需氧环境，而且它具有生化反应的惰性，所以其传统的生化鉴定较为困难。PCR这一分子生物学手段要比传统方法快速灵敏，双重PCR又比传统PCR方法特异性更强，可靠性更高。

本试验根据空肠弯曲杆菌mapA和hip O 基因序列设计两对引物，用于空肠弯曲杆菌的检测，结果表明该二重PCR方法对空肠弯曲杆菌具有特异性，而对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等其他细菌均不能扩增出特异性片段。这种方法的建立大大节省了生化试验所消耗的成本和时间，而且特异性、敏感性高，更加适用于临床和流行病学调查。

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