人参皂苷Re对大鼠心室肌细胞钠、钾离子通道的影响

孟红旭 姚明江 刘建勋

（中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京，100091）

人参皂苷Re对大鼠心室肌细胞钠、钾离子通道的影响

孟红旭 姚明江 刘建勋

（中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京，100091）

目的：观察人参皂苷Re对大鼠心室肌细胞电压依赖性的钠、钾离子通道的影响，揭示其抗心律失常的作用机制。方法：采用酶分法获得单个大鼠心室肌细胞，在全细胞膜片钳技术模式下，记录电压依赖性钠通道、瞬时外向钾通道和内向整流钾通道电流，并观察不同浓度的人参皂苷Re对电流幅度的影响。结果：给予人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）后钠通道电流幅度呈现减小的趋势，对通道电流幅度的抑制率分别为（25.5±5.7）%（n＝3）和（46.2±18）%（n＝4）。给予人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）对瞬时外向钾电流幅度略有抑制，洗脱后电流恢复，其中100μmol·L-1人参皂苷对电流的抑制率为（13±9）%（n＝3）。给予人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）后内向整流钾电流幅度呈现逐渐减小的趋势，药物洗脱后电流完全恢复，（10，100μmol·L-1）对通道电流幅度的抑制率分别为（16.3±8.7）%（n＝5）和（35.4±11.2）%（n＝5）。结论：人参皂苷Re能够抑制心室肌细胞电压依赖性的钠通道、瞬时外向钾通道和内向整流钾通道电流发挥抗心律失常的作用。

人参皂苷Re；膜片钳；钠通道电流；钾通道电流

人参皂苷Re（Ginsenoside Re）是人参根中的主要人参皂苷类物质，属三醇类人参皂苷。大量研究证明人参皂苷对离体心肌细胞和多种动物心肌缺血、心肌梗死、再灌注损伤均具有保护作用［1］，从人参化学成分与抗心律失常构效关系来看，人参皂苷Re抗心律失常活性最强［2］。最近研究表明人参皂苷Re能够通过抑制心肌细胞L-型钙电流和增强延迟整流钾电流缩短动作电位发挥抗心律失常的作用［3］，但是人参皂苷Re对钠电流及其他类型钾电流的作用还不清楚。我们在通过膜片钳技术观察了人参皂苷Re对大鼠心室肌细胞电压依赖性钠通道、瞬时外向钾通道和内向整流钾通道电流的影响。

1 材料和方法

1.1 药物和试剂

1.1.1 药物 人参皂苷Re由中国药品生物制品检定所购置；配液所需药品除指定外皆由英国Alfa Aesar公司购置。

1.1.2 试剂（mmol／L） 无钙台式液：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10（pH7.4 NaOH）；KB液：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10（pH7.4 KOH）；记录钠电流细胞外液：Choline chloride 130，NaCl 10，MgCl21，NaH2PO40.33，CsCl 5.4，CaCl20.1，CoCl20.1，Glucose 10，HEPES 10（pH 7.4 CsOH）；记录钠电流电极内液：NaCl 5，MgATP 5，CsCl 20，CsF110，MgCl21 EGTA 5，HEPES 5（pH 7.2 CsOH）；记录钾电流细胞外液：Choline chloride 135，KCl 5.4，MgCl21.1，CaCl21.8，CdCl20.5，Glucose 10，HEPES 10（pH 7.4 KOH）；记录钾电流电极内液：KCl 140，Na2ATP 5，MgCl21，EGTA 5，HEPES 10，Glucose 10，（pH 7.2 KOH）

1.2 心室肌细胞的分离［4］取SD大鼠（180±10）g，♂，10%乌拉坦腹腔麻醉，迅速开胸取出心脏，在零度无钙台式液中剥离出主动脉，悬挂于Langendorff心脏灌流装置上，确保管口不超过主动脉的心脏入口，棉线固定，行主动脉逆行灌流，流量为7～8 mL／min。先用无钙台氏液灌流5 min，接着用含酶钙台氏液（0.4 mg／mL胶原酶Ⅱ（worthington）+0.03 mg／mL蛋白酶ⅩⅣ（sigma）+0.9 mg／mL牛血清白蛋白（sigma）+ CaCl20.05mmol／L）灌流19～24 min，最后用低钙台式液（CaCl20.4mmol／L）灌流5 min，剪取心室组织在KB液中剪碎，吹打，用100目筛网过滤，最后将细胞保存在KB液中，4℃低温状态下，细胞可存活36h。整个过程灌流液维持温度在（37±1）℃，灌流液中充纯氧气。

1.3 离子通道电流的记录 通过电极拉制仪（PULL -100，美国）拉制电极，使玻璃电极充电极内液后阻抗达到2～4MΩ。吸取几滴细胞悬液加入细胞池中，细胞贴壁后选择杆状、表面光滑、纹理清晰的心肌细胞，利用三维操纵器移动电极贴近目标细胞，并轻压在细胞表面，稍加负压即可形成1GΩ水平以上的高阻抗封接，再用较大负压吸破细胞膜，形成全细胞记录形式。实验过程由刺激采集软件Pulse控制，经膜片钳放大器（EPC10，德国），通过模数转换采集数据，存放于计算机硬盘。

记录钠电流：采用氯化胆碱替代细胞外大部分Na+，采用Co2+抑制电压依赖性钙通道，Cs+替换K+。给予细胞钳制在-110 mV，给予-30mV，25ms的除极电压，可以得到迅速活化，迅速缓慢失活的内向电流，这种电流能够被河豚毒素（TTX）0.001mmol·L-1阻断。细胞钳制在-120 mV，给予细胞一系列从-90 mV～40 mV，以10 mV步增，脉宽25 ms的测试电压，可以记录到随不同刺激电压产生的电流轨迹，测量各个电流轨迹的峰值电流制作给药前后电流电压曲线。记录瞬时外向钾通道电流：采用采用氯化胆碱替代细胞外Na+，采用Cd2+抑制电压依赖性钙通道。细胞钳制在-70mV，给予细胞一系列从-40 mV～50 mV，以10 mV步增，脉宽250 ms的测试电压，可以得到一组迅速活化，迅速失活的外内向电流，这种电流能够被4 -AP（0.5mmol·L-1）阻断。记录内向整流钾通道电流：将细胞钳制在-40mV，给予细胞一系列从-120mV～30 mV，以10mV步增，脉宽500ms的测试电压，可以得到一组几乎不失活的稳态电流，在超极化时为很大的内向电流，去极化时变为较小的外向电流，这种电流可被TEA阻断。

2 结果

2.1 人参皂苷Re对钠通道电流的影响 给予人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）后，单一去极化电压刺激后，钠通道电流幅度呈现逐渐减小的趋势（图1A），对通道电流幅度的抑制率分别为（25.5±5.7）%（n＝3）；（46.2±18）%（n＝4）。给予不同的刺激电压后，各电流峰值呈减小趋势（图1B）制作电流电压曲线后发现给药后电流电压曲线上移，峰值电压无明显改变（图1C）。

图1 人参皂苷Re对钠电流的抑制作用：A.人参皂苷Re（10.100μmol·L-1）对电流峰值的作用，洗脱后回复明显。B.人参皂苷Re对一组刺激电压诱导出的钠电流轨迹影响。c.取电流峰值制作电流电压曲线。

2.2 人参皂苷Re对瞬时外向钾通道电流（Ito）和内向整流钾通道电流（Ik1）的影响 在记录两种钾电流时我们发现在受到组合电压刺激后通道电流会出现随时间经过的自发衰减，对评价药物作用发生影响，因此在观察药物的作用时，采用双刺激电压。给予人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）对后Ito幅度略有抑制（图2A），，物洗脱后电流恢复，其中100μmol·L-1人参皂苷对电流的抑制率为（13±9）%（n＝3）。给予人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）后Ik1幅度呈现逐渐减小的趋势，药物洗脱后电流完全恢复（图2B）。经过统计（10，100μmol·L-1）人参皂苷Re对通道电流幅度的抑制率分别为（16.3±8.7）%（n＝5）和（35.4± 11.2）%（n＝5）。

图2 人参皂苷Re对钾电流的抑制作用：A.人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）对双刺激电压诱导出的Ito轨迹影响；B.人参皂苷Re（10，100μmol·L-1）对双刺激电压诱导出的Ik1轨迹影响。

3 讨论

钠通道一般是I类抗心律失常药物的靶点。近些年心肌细胞的电生理研究表明：缺血后细胞内的无氧代谢导致细胞内pH值的降低及由此引发的细胞内Na+超载，过多的Na+进入导致Na+-Ca2+交换作用的反转，即细胞外的Ca2+流入细胞内，排出细胞内过多的Na+，细胞内的游离Ca2+增加，此时，由于缺氧使心肌细胞内质网、线粒体等细胞器摄取Ca2+能力下降，从而导致了Ca2+超载的发生。细胞内的Ca2+超载会引起磷脂酶、蛋白水解酶等的激活，导致肌原纤维挛缩断裂，生物膜机械损伤，细胞骨架破坏，心肌细胞发生不可逆损伤［5-6］。因此，通过抑制钠通道来抑制Na+超载，从而阻断Ca2+超载的发生对心肌细胞的缺氧保护作用具有重要意义。本实验发现，人参皂苷Re能够浓度依赖性的抑制心肌细胞钠电流，表明人参皂苷Re抗心律失常的作用，可能与此有关。

传统Ⅲ类抗心律失常药通过阻滞心肌的钾通道发挥作用，心肌细胞膜上的钾通道亚型多，性质复杂。Ik1主要作用在于维持心肌细胞的静息膜电位，在膜超极化状态下，钾离子具有内流趋势，使膜恢复静息期电位；在去极化状态下，钾离子具有外流趋势，恢复膜原有的极化状态［7］。人参皂苷Re抑制Ik1的内向成分，可能在静息期使膜电位向超极化方向变化，膜兴奋性降低，对于阈下刺激或“额外”刺激反应性降低，发挥其抗心律失常的作用。

心肌细胞的钠通道密度大且通道电流动力过程相当快，所以由串联电阻的电压引起钳制水平的漂移和对膜电容充放电速度的影响对所测INa干扰非常严重，因此对串联电阻和膜电容补偿要求很高。为减少上述干扰，本实验在测定INa时，用氯化胆碱代替部分氯化钠，使细胞内外钠离子浓度差降至30mmol／L，并在室温下（20～22℃），而不采取通常的37℃进行实验，这样可明显减少INa幅度，保证了实验结果的准确性。

我们的研究首次发现人参皂苷Re能够抑制心肌细胞钠电流和内向整流的钾电流，这个结果表明人参皂苷Re不仅通过抑制L-型钙电流和增强延迟整流钾电流，而且通过抑制钠电流和内向整流的钾电流发挥抗心律失常的作用。

［1］赵立波，佟力，赵洪序，等.人参总皂甙对心肌缺血再灌注损伤的保护作用实验研究［J］.中华胸心血管外科杂志，1994，10（4）：353-354.

［2］陈英杰，王红燕，徐绥绪，等.人参化学成分及其抗癌抗心律失常构效关系的研究［J］.中国科学基金，1995，46：46.

［3］BaiCX，SunamiA，Namiki T，etal.Electrophysiologicaleffects ofginseng and ginsenoside Re in guinea pig ventricularmyocytes［J］.Eur JPharmacol，2003，476（1-2）：35-44.

［4］孟红旭，王宝，刘建勋.丹酚酸B和延胡索乙素对大鼠心室肌细胞L -型钙通道的影响［J］.中国中西医结合杂志，2011，31（11）：1514-1517.

［5］Laustein MP，LedererW.Sodium／calcium exchange：its physiological implications［J］.Physiol Rev，1999，79（5）：763-854.

［6］Baetz D，Bernard M，Pinet C.Different pathways for sodium entry in cardiac cells during ischemia and early reperfusion［J］.Mol Cell Biochem，2003，242（1-2）：115-120.

［7］Miake J，Marban E，Nuss HB.Functional role of inward rectifier current in heart p robed by Kir22 overexpression and dominant negative suppression［J］.JClin Invest，2003，111（10）：1529-1536.

（2013-09-12收稿）

Effects of Ginsenoside Re on Sodium and Potassium Current in Rat Ventricular Myocytes

Meng Hongxu Yao Mingjiang，Liu Jianxun
（Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing key Laboratory of pharmacology of Chinesemateriamedica，Beijing 100091，China）

Objective：To investigate the effectsof Ginsenoside Re on voltage-dependent sodium current and potassium current in rat ventricularmyocytes，and to investigate themechanism of antiarrhythmia.Methods：The effectofGinsenoside Re on sodium current（INa），transient outward potassium current（Ito）and inwardly rectifie-d potassium current（Ik1）were assessed by applying whole-cell patch clamp technique in single cardiac myocytes.Results：Ginsenoside Re（10，100μmol·L-1））was shown to inhibit the altitude of INaand the inhibition ratio was25.5±5.7%（n＝3）and 46.2±18%（n＝4）.Itwas shown a little inhibition by Ginsenoside Re（100μmol ·L-1））and its effectswere reversible completely afterwashout.The inhibition ratio of Ito was 13±9%（n＝3）in 100μmol·L-1）. Ginsenoside Re（10，100μmol·L-1））inhibited the altitude of Ik1and the inhibition ratiowas16.3±8.7%（n＝5）and 35.4±11.2%（n＝5）.Conclusion：Ginsenoside Re can inhibit sodium current and potassium currents to produce antiarrhythmic effect.

Ginsenoside Re；Pathch clamp technique；Sodium current；Potassium current

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.10.005

中国中医科学院自助选题项目（编号：zz070821），科技部十二五重大新药创制课题（编号：2012ZX09301002-004）

孟红旭，男，博士，助理研究员，研究方向中药药理学，E-mail：am fd003＠163.com

刘建勋，男，研究员，博士生导师，主要从事心脑血管药理学研究，Tel：010-62835601，E-mail：liujx0324＠sina.com