二维斑点追踪成像评价新生猪缺氧缺血性脑病模型受损心肌圆周运动

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是由围生期窒息所致的严重新生儿疾病，心脏是常见的受累器官之一。利用超声心动图对HIE患儿心功能进行检测可早期评价新生儿HIE并发心功能损害[1,2]，但针对心肌运动进行检测和定量评价的研究较少。二维斑点追踪成像（STI）技术能够通过测量心肌在各个运动方向的应变来反映和评价整体及局部心肌真实的运动情况和功能状态[3]。本研究在新生猪HIE模型的基础上，利用STI技术测量心肌圆周应变及圆周应变率（SrC），以期了解缺氧缺血性心肌损伤后心肌圆周运动的变化，观察心肌组织的病理改变，为研究新生儿HIE合并心肌损伤提供动物实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立 新生3～5 d健康雄性约克猪18只，体重2～2.5 kg，随机抽签分为对照组（n=8）和模型组（n=10）。模型组：温度保持在28～30℃，于无菌条件下行腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉、气管插管（φ2.5 mm）、机械通气（TKR-200C小动物呼吸机）。经颈旁正中切口钝性剥离并阻断双侧颈总动脉，同时机械通入6% O2与94% N2混合气体30 min，监测心率及血氧饱和度。造模结束后恢复双侧颈总动脉血供，吸入40% O2，进行缝合、包扎。对照组：手术过程同模型组，但不阻断双侧颈总动脉血流，机械通入40%O2。待意识恢复后撤掉呼吸机及气管插管，置于恒温箱中（设定温度＞32℃），维持体温38.5～39.5℃，以0.9%NaCl注射液5 ml/（kg∙h）静脉滴注补液，能进食后每6小时给予奶粉30～60 ml。出现心率下降（＜100次/min）时，每次给予肾上腺素0.01 mg/kg静脉注射，出现抽搐给予苯巴比妥钠20 mg/kg静脉注射，维持量5 mg/（kg∙d）静脉滴注，严重时呼吸机维持机械通气（40% O2）[4]。1.2 超声检查 模型制备24 h后行超声检查。采用GE Vivid 7超声显像仪，7S探头，探头频率2.5～6.0 MHz，麻醉后取左侧卧位，连接同步导联心电图。于胸骨旁采集基底段、中间段和心尖段短轴二维动态图像，帧频75～140帧/s，保存5个心动周期，在EchoPAC工作站对图像进行脱机分析。选择清晰图像，定帧于收缩期末，手动勾画感兴趣区（ROI），调整ROI至各节段追踪满意，获得各节段心肌圆周应变及应变率曲线。设定R波顶点为舒张期末，测量主动脉瓣关闭时间确定收缩期末，心动周期在两个R波顶点之间。记录各节段圆周应变峰值（SC）、收缩期圆周应变率峰值（SrC S）、舒张早期圆周应变率峰值（SrC E）、舒张晚期圆周应变率峰值（SrC A），计算基底段、中间段、心尖段及整体水平平均值，记录心率。利用改良Simpson法[5]测量并计算左心室射血分数（LVEF）。计算Tei指数[2]：二尖瓣环后间隔处组织多普勒频谱Aa峰结束至Ea峰开始时间为A，Sa峰开始至结束时长为B，Tei=（A―B）/B。

1.3 重复性检验 随机抽签从对照组和模型组中各抽取4只猪，由2名相同资历的检查者按上述方法追踪获取各节段心肌圆周应变曲线，计算整体水平SC；同一检查者于不同时间对同一病例测量2次。比较检查者间及检查者内的一致性。

1.4 病理检查 超声检查结束后处死新生猪，用10%KCl 10 ml静脉注射，取基底节区脑组织、左心室前乳头肌及其旁室壁心肌组织用10%福尔马林溶液固定，进一步脱水包埋切片，脑组织切片行HE染色，心肌组织切片行HE染色及凋亡检测（POD法，博士德MK1020）。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，对照组与模型组间计量资料比较采用成组t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。重复性检验采用Bland-Altman分析，采用GraphPad Prism 5绘图。

2 结果

2.1 造模情况 模型组新生猪造模后皮肤、口鼻发绀，全身抽搐，四肢呈“划桨样”运动，头部颤抖，颈强直；对照组未见明显异常运动。两组新生猪实验期间均未出现死亡。

2.2 两组左心室心肌圆周应变及应变率比较 模型组基底段、中间段、心尖段及整体水平SC、SrC S、SrC E、SrC A均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

2.3 两组心率及心功能比较 模型组心率较对照组快，LVEF较对照组低，Tei指数较对照组高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 重复性检验 Bland-Altman分析图显示，检查者间及检查者内测值一致性均较高。

2.5 心肌组织凋亡检测及病理检查 对照组心肌组织切片胞核均蓝染；模型组可见散在胞核呈金棕色（图2）。对照组心肌细胞排列整齐，胞核清晰，细胞无肿胀；模型组心肌细胞肿胀，排列紊乱，部分胞质内出现空泡，部分胞核肿胀、淡染，核膜、核仁显示不清（图3）。对照组神经元胞质丰富，核清晰可见，核仁清楚；模型组神经胶质细胞肿胀，神经元细胞胞质淡染、出现空泡，部分神经元细胞膜破坏，胞核肿胀、淡染，核膜、核仁显示不清（图4）。

表1 新生猪HIE模型组与对照组各水平圆周应变峰值及圆周应变率比较

图1 对照组（A）与模型组（B）中间段短轴圆周应变曲线，与对照组比较，模型组中间段短轴各节段应变峰值减低，曲线形态低平、不规整

图2 心肌凋亡检测。模型组（B）可见凋亡心肌细胞胞核（箭），而对照组（A）胞核均匀蓝染（HE, ×400）

图3 心肌组织病理示模型组（B）心肌细胞胞核不清（箭），而对照组（A）胞核清晰（HE, ×400）

图4 脑组织病理示模型组（B）基底节神经元细胞胞质空泡（箭），胞核不清（箭头），而对照组（A）胞质丰富，胞核清晰（HE, ×400）

表2 新生猪HIE模型组与对照组心率及心功能指标比较

3 讨论

新生猪与新生儿的体型大小及生长发育等较为相近，通过暂时性全脑缺血加机械低氧通气建立新生猪HIE模型的实验方法，缺氧条件稳定，重复性良好，对新生儿HIE模拟结果较可靠[4]。本实验中模型组新生猪脑组织细胞变性，部分可见坏死，证实造模成功。

HIE造成心肌损伤的机制为：①缺氧后无氧酵解增加，引起细胞内酸中毒；ATP生成障碍引起细胞膜离子泵功能受损；线粒体损伤与细胞内钙超载导致钙依赖性酶的激活；上述原因导致膜磷脂降解、蛋白质分解甚至DNA水解，造成组织细胞变性、坏死、凋亡等[6,7]。②脑损伤造成继发性心肌损伤，包括儿茶酚胺合成增多、交感与副交感神经支配失衡以及肽能神经作用等，可以加重心肌缺氧缺血，引起心律紊乱及心血管反射调节紊乱等[8]。本实验中模型组心肌组织内可检测到散在的凋亡细胞，而对照组则无凋亡发生；既往研究[9]曾报道模型组心肌HE染色结果，但凋亡检测情况鲜有报道。

模型组LVEF低于对照组，Tei指数高于对照组，均表明造模后左心室功能下降。既往利用超声心动图技术对早期评价新生儿HIE并发心功能损害有一定意义[1,2]，如LVEF能反映左心室整体泵血功能下降，Tei指数能反映左心室整体功能降低，M型超声能够发现室壁运动幅度及左心室短轴缩短率降低。心肌应变及应变率能够同时反映局部及整体心肌在各个方向的运动，可进一步观察HIE合并心肌损伤所致的心肌运动异常。心肌应变指心肌在心动周期中由心肌纤维的收缩和舒张运动所引起的形变，反映心肌的机械特性，心肌整体和各节段的应变值可以用来评价相应的心肌功能。STI技术利用软件对心肌组织内部回声斑点的空间运动进行追踪识别，跟踪其在每一帧图像中的位置，描记其在心动周期中的运动轨迹，以此来计算心肌运动多项参数，分析心肌运动的力学特征；同时克服了声束方向、角度及取样位置等的限制，能够从纵向、径向、圆周等方向对心肌运动进行研究，定性、定量地反映心肌运动状态和功能[3]。

模型组左心室基底段、中间段、心尖段及整体水平心肌圆周应变峰值及各时相应变率峰值均较对照组明显减低，心肌圆周应变及应变率曲线较对照组低平，说明造模后各节段心肌组织圆周方向收缩、舒张运动均受到损伤。圆周运动是心肌短轴方向的环形运动，其应变值反映了室壁在心动周期中环形的缩短与伸长的程度，是左心室心肌一种较为重要的运动方式。Yan等[10]研究显示，在射血分数保留（LVEF＞45%）的冠状动脉疾病患者中，存在碎片状QRS波（fQRS）的患者与非fQRS患者相比，各水平圆周应变明显减低，整体水平圆周应变降低是fQRS的危险因素，能够预测心脏不良事件。王其海等[11]研究发现，冠状动脉不同程度狭窄患者相关节段圆周应变较正常对照组减低，其圆周应变峰值绝对值与冠状动脉狭窄程度呈负相关。

造模后24 h，新生猪心肌损伤表现为细胞变性，偶见点灶状坏死，并出现散在的心肌细胞凋亡。在心肌细胞损伤的基础上，左心室心肌收缩期与舒张期圆周运动均明显减弱，说明HIE合并心肌损伤时圆周方向环形肌纤维受累，而心肌圆周应变及应变率检测可以早期评价新生儿HIE合并心肌损伤。由于心肌细胞是不可再生细胞，未来若能建立局部心肌细胞坏死、凋亡程度与相应节段应变及应变率峰值的关系，将对新生儿HIE合并心肌损伤的预后有重要临床意义。

由于STI技术易受到图像质量的制约而产生追踪和测量误差。本研究中使用的7S探头常用于婴幼儿检查，不是专用的动物探头，但7S探头分辨力尚好，3～5 d新生猪与同日龄新生儿躯干部分大小相似，心脏体积接近，且胸壁较薄，图像质量尚好。造模后心率加快，需要及时增加帧频，当直接调节到极限时，需要牺牲图像宽度和深度来进一步增加帧频，确保曲线质量。通过抽样进行的重复性检验显示，本研究中数据测量在检查者间及检查者内一致性均较好。

总之，利用新生猪HIE模型能够复制新生儿HIE合并心肌损伤，通过STI技术检测圆周应变及应变率能够早期评价新生猪HIE的心肌损伤情况，可以为新生儿HIE合并心肌损伤的研究提供动物实验基础，为新生儿窒息后多器官缺氧缺血性损伤的深入研究提供可靠的动物模型。

[1]Wei Y, Xu J, Xu T, et al. Left ventricular systolic function of newborns with asphyxia evaluated by tissue Doppler imaging.Pediatr Cardiol, 2009, 30(6): 741-746.

[2]Ichihashi K, Yada Y, Takahashi N, et al. Utility of a Dopplerderived index combining systolic and diastolic performance(Tei index)for detecting hypoxic cardiac damage in newborns.J Perinat Med, 2005, 33(6): 549-552.

[3]Perk G, Tunick PA, Kronzon I. Non-Doppler two-dimensional strain imaging by echocardiography--from technical considerations to clinical applications. J Am Soc Echocardiogr,2007, 20(3): 234-243.

[4]王晓明, 郭启勇, 林楠, 等. 新生猪缺氧缺血性脑病的扩散成像与病理学相关研究. 中国医学影像技术, 2005, 21(1):18-22.

[5]王新房. 超声心动图学. 第4版. 北京: 人民卫生出版社,2009: 231.

[6]Kristián T, Siesjö BK. Calcium in ischemic cell death. Stroke,1998, 29(3): 705-718.

[7]Asano G, Takashi E, Ishiwata T, et al. Pathogenesis and protection of ischemia and reperfusion injury inmyocardium. J Nippon Med Sch, 2003, 70(5): 384-392.

[8]de Zeeuw S, Lameris TW, Duncker DJ, et al. Cardioprotection in pigs by exogenous norepinephrine but not by cerebral ischemia-induced release of endogenous norepinephrine.Stroke, 2001, 32(3): 767-774.

[9]吴琳, 黄国英, 林其珊, 等. 新生猪窒息模型的心肌损害的研究. 中华儿科杂志, 2003, 41(10): 766-769.

[10]Yan GH, Wang M, Yiu KH, et al. Subclinical left ventricular dysfunction revealed by circumferential 2D strain imaging in patients with coronary artery disease and fragmented QRS complex. Heart Rhythm, 2012, 9(6): 928-935.

[11]王其海, 汪太平, 徐岩, 等. 应用超声斑点追踪成像技术研究缺血心肌的收缩期峰值圆周应变的变化规律. 中国循环杂志, 2010, 25(2): 128-131.