黄花草木樨种子蛋白质含量测定及其提取工艺研究

赵海阳,林年丰,包海鹰*

(1.吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118;2.吉林大学环境与资源学院,吉林长春130026)

黄花草木樨(Melilotus officinalis)又名墨里老笃,金花草,黄甜车轴草,草木樨等,属于豆科草木樨属。1年生或2年生草本植物[1],具有适应性广、抗逆性强、耐旱、耐寒、耐脊和耐盐碱等特性[2]。我国四川及长江流域以南各省区有野生,东北、华北、西北及西藏各省区都有栽培,欧洲各国也有栽培。宜种于半干燥、温湿地区。为水土保持优良草种,并为绿肥且花为一种良好的蜜源[3];花干燥后,可直接拌入烟草内作芳香剂。适合在干旱环境中的沙质土壤、沙土和中碱性土壤(pH≤9)中种植,具有从空气中吸收氮的能力,除满足自身氮需求外,大部分氮聚集于土壤中。黄花草木樨富含蛋白质,种植它可以获得高质量的青贮饲料和干草饲料,干燥后加工草粉,可作为精饲料。黄花草木樨中含有丰富的生物活性成分,如含有香豆素类、黄酮类、酚酸类、甾体类、三萜类、糖类、蛋白质类等化学成分[4-5]。黄花草木樨具有止咳平喘,抗炎抗菌,散结止痛、改变血管通透性、促进血液循环、芳香化浊、调节免疫、截疟等功效[6-7]。目前,对黄花草木樨利用较多的是从中提取精油、香树脂、净油和浸膏等,对于黄花草木樨蛋白质的研究还没有先例,本文利用碱提酸沉法研究黄花草木樨种子蛋白质的提取工艺,确定了最佳提取条件,为黄花草木樨的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 主要材料:1999年从俄罗斯西伯利亚地区引进的俄罗斯原种种植的黄花草木樨。主要试剂:氢氧化钠、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、甲基红、溴甲基酚绿、乙醇、盐酸。主要仪器:恒温水浴锅:HHS4数显恒温水浴锅,金坛市晶玻实验仪器厂;精密pH计:PHS23C型,上海金鹏分析仪器有限公司;低速台式冷冻离心机:T.D.L-5000-CR,上海安亭科学仪器厂;高速台式冷冻离心机:T.G.L-20000-CR;电热鼓风干燥箱:101A23ET,上海实验仪器厂有限公司;分析天平:AL204,METTL ER TOL EDO;凯氏定氮仪。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白质含量测定 利用凯氏定氮法GB/T14489.2-2008,多次测定脱脂后的黄花草木樨种子的蛋白质含量,计算相对标准偏差,并求出平均值,方为黄花草木樨种子的蛋白质含量。

1.2.2 蛋白质提取工艺 具体操作步骤:脱脂后的黄花草木樨种子,在一定的温度下,加入一定体积,一定pH值的氢氧化钠溶液,搅拌提取1 h,用离心机以3 500 r/min离心20 min,去沉淀,取上清液用0.05 mol/L的HCI调节pH值至一定值,4 000 r/min离心20 min分离除去上清液,将得到的蛋白质沉淀加入4倍的蒸馏水,4 000 r/min离心20 min除去废水,40℃干燥48 h后得粗蛋白备用[8]。

1.2.3 黄花草木樨种子的预处理 将黄花草木樨种子过筛,粉碎,后再过筛,然后用石油醚回流脱脂。脱脂干燥后贮存于棕色试剂瓶中备用[9]。

1.2.4 黄花草木樨种子蛋白质提取工艺的优化 1)碱溶pH值的确定试验:在碱溶温度35℃,料液比1∶10(W∶V),搅拌提取l h,酸析pH值为4的条件下,分别取碱溶pH值6.0、8.0、10.0、12.0、14.0,以蛋白质提取率为评价指标,考察碱溶pH值对蛋白质提取效果的影响。2)酸析pH值的确定试验:在碱溶温度为35℃,碱溶pH值为10.0,料液比1∶10(W∶V)的条件下,分别取酸析pH值3.8、4.0、4.2、4.4、4.6,以蛋白质提取率为评价指标,考察酸析pH值对蛋白质提取效果的影响。3)料液比的确定试验:在碱溶温度为35℃,pH值为10.0的碱液中,搅拌提取l h,酸析pH值为4.0的条件下,分别取料液比l∶5、l∶10、1∶15、l∶20、l∶25(W∶V),以蛋白质提取率为评价指标,考察料液比对蛋白质提取效果的影响。4)提取温度的确定试验:在pH值为10.0的碱液中,料液比1∶10(W∶V),提取1 h,酸析pH值为4.0的条件下,分别取提取温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃以蛋白质提取率为评价指标,考察温度对蛋白质提取效果的影响。5)提取工艺的优化试验:在单因素的基础之上,确定碱溶pH值、酸析pH值、料液比、提取温度4因素的因素水平,以蛋白质的提取率为评价指标,设计正交试验,优化黄花草木樨种子蛋白质的提取工艺。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 黄花草木樨种子蛋白质提取率的测定[10]按以下公式计算:蛋白质提取率=干燥后得到的蛋白质(g)/脱脂草木樨种子粉中总的蛋白质(g)×100%。

2 结果与分析

2.1 测定 黄花草木樨种子蛋白质含量,见表2。

表2 黄花草木樨种子蛋白质的含量%

由表2经计算可知,黄花草木樨种子蛋白质含量的平均值为51.14%,标准偏差(SD)为0.107 788,相对标准偏差(RSD)为0.2%。重复性试验,按拟订的含量测定方法对同一批样品进行多次测定计算相对标准偏差,数值越小所测结果越准确,由此可知,本试验结果符合要求,所测结果可靠。

2.2 单因素实验及其分析

2.2.1 碱溶pH值的确定 碱溶pH值对蛋白质提取率的影响,见图1。

图1 碱溶pH值对蛋白质提取率的影响

由图1可知,蛋白质的提取率是随着pH值的升高而升高,但pH值达到12时提取率开始有所下降。因此,选择碱溶pH值12.0较为合适。

2.2.2 酸析pH值的确定 酸析pH值对蛋白质提取率的影响,见图2。

由图2可知,酸析pH值为4.4时,蛋白质的提取率最高,高于或者低于4.4,蛋白质的提取率都有所下降,可能的原因是黄花草木樨种子蛋白的等电点接近4.4,在酸析PH值为4.4时,得到的蛋白质沉淀较多,提取率最高。所以,选择酸析pH值为4.4。

2.2.3 料液比的确定 料液比对蛋白质提取率的影响,见图3。

图2 酸析pH值对蛋白质提取率的影响

图3 料液比对蛋白质提取率的影响

由图3可知,当料液比为1∶15时,蛋白质的提取率最高。在料液比由1∶5上升到1∶15时,随着料液比的增加,蛋白质的溶解增加,蛋白质的提取率升高。料液比达到1∶15后继续增加,蛋白质的提取率降低,可能的原因是料液比过高,导致酸析有困难。选择料液比为1∶15(m∶v)。

2.2.4 提取温度的确定 温度对蛋白质提取率的影响,见图4。

图4 温度对蛋白质提取率的影响

由图4可知,温度的高低对蛋白质的提取率有较大的影响。随着温度的升高,蛋白质提取率增大,但温度过高会引起蛋白质变性[11],提取温度从35～50℃提取率升高趋于平缓,考虑节约能源和保持蛋白质功能特性,选择提取温度为35℃。

2.3 正交试验及分析 L9(34)正交试验设计及结果见表3。由表3极差R分析可知影响蛋白质提取的各个因素主次关系为:A(碱溶pH值)＞D(料液比)＞B(酸析pH值)＞C(提取温度)。由K值大小可知,本试验确定的最优工艺条件为A3D2B3C1,即为碱溶pH值12,酸析pH值4.6,提取温度30℃,料液比1∶15(m∶v)。

表3 L9(34)正交试验设计及结果

2.4 最优工艺的验证实验 按照最优工艺条件为碱溶pH值12,酸析pH值4.6,提取温度30℃,料液比1∶15(M∶V)进行验证试验,实测蛋白质的提取率为56.94%,大于正交试验中55.93%最好水平,说明最佳提取方式组合是合理有效的。

3 结论

本实验通过利用凯氏定氮法,多次测定黄花草木樨种籽的蛋白质含量,计算相对标准偏差,计算平均值得出黄花草木樨种籽蛋白质含量为51.14%,可知黄花草木樨种子中蛋白质含量较高,具有很大的开发利用价值。本实验还利用碱提酸沉法从脱脂的黄花草木樨种子中提取蛋白质,通过单因素及正交试验确定蛋白质提取的最优工艺为碱溶pH值12,酸析pH值4.6,提取温度30℃,料液比1∶15(M∶V),在该条件下蛋白质的提取率最高,为56.94%。

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